環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠制備固定化金屬親和層析介質

環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠制備固定化金屬親和層析介質

1環(huán)氧氯丙烷法隨著生物技術的發(fā)展，固定化金屬親和色度技術（imac）技術在蛋白質中的分離和精制（imark）。通常環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖都以水為反應介質,環(huán)氧氯丙烷在水中的溶解度約為6.58%左右,因此該反應是一個復雜的油(環(huán)氧氯丙烷)-水-固(凝膠)三相反應體系,反應速率較慢;同時環(huán)氧化過程中環(huán)氧基在堿性條件下極易發(fā)生水解副反應,需要對反應條件進行全面優(yōu)化和嚴格控制才能獲得較高的活化效率本工作考察了環(huán)氧氯丙烷在DMSO中對瓊脂糖凝膠Sepharose6FF進行活化的反應條件,結果表明通過條件優(yōu)化環(huán)氧基密度可達163μmol/mL.以IDA為螯合劑制備出了高金屬離子密度的Cu2材料和方法2.1bsa、環(huán)氧氯丙烷、乙二胺四乙酸四乙酸四乙酸四乙酸四乙酸四鈉dmso及unimasic瓊脂糖凝膠Sepharose6FF購自瑞典GEHealthcare公司,牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA)購自美國Sigma公司,其他試劑包括二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)、環(huán)氧氯丙烷(Epichlorohydrin,ECH)及IDA、乙二胺四乙酸四鈉鹽(EthylenediamineTetraaceticAcid,EDTA)、五水硫酸銅、咪唑等均為分析純,購自北京化學試劑公司.Unico2800紫外-可見分光光度計(美國Unico公司).2.2實驗方法2.2.1dmso溶液的配制量取保存于20%(?)乙醇水溶液中的Sepharose6FF約20mL(沉降體積),在G4沙芯漏斗中用蒸餾水反復洗滌以除去乙醇,真空抽干至無水滴滴下.向介質中依次加入20%,50%,70%(?)的DMSO水溶液各40mL,攪拌清洗5min,每次清洗后用真空抽干清洗液.從處理好的瓊脂糖凝膠中稱取6份每份約1.0g介質加入50mL錐形瓶中,向每份介質中依次加入一定量DMSO,ECH,H2.2.2ida和cu取約15g環(huán)氧氯丙烷活化過的瓊脂糖凝膠,加入50mL含1.0mol/LIDA,2.0mol/LNaCu2.2.3imac介質對bsa的吸附和洗脫BSA在IMAC介質上的吸附平衡實驗在含0.5mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸緩沖液(pH5.0)中進行.吸附前先將制備好的IMAC介質在緩沖液中平衡24h以上,真空抽濾后準確稱取一系列約0.1g的介質于三角瓶中,加入10mL初始濃度為0～2.0mg/mL的BSA溶液,將三角瓶置于25℃搖床中,在170r/min下振蕩20h,取出,離心15min,以未加蛋白的空白為參比液,在280nm下測定上清液的吸光度.根據(jù)物料平衡計算吸附量:其中,q為蛋白質的吸附量(mmol/L),c分別采用由pH5.0的吸附緩沖液配制的0.2mol/L咪唑溶液及0.05mol/L的磷酸緩沖液(pH8.0)對吸附在IMAC介質上的BSA進行洗脫.首先稱取2份0.1gIMAC介質于三角瓶中,加入6mL1.5mg/mLBSA溶液,25℃下于160r/min搖床中吸附20h后,離心測定上清液的吸光度,計算吸附在介質上的BSA量.移去上清液后,向介質中分別加入6mL咪唑溶液或pH8.0的磷酸緩沖液對BSA進行洗脫,間隔一定時間測定上清液中洗脫下的BSA濃度,根據(jù)物料衡算計算出BSA的洗脫率.2.3分析2.3.1ida配基密度的測定IDA為弱酸,可采用過量強堿滴定后再用鹽酸滴定剩余強堿的方式來測定IDA-Sepharose凝膠表面的羧基含量,具體步驟為:準確稱取IDA-Sepharose微球0.1g于錐形瓶中,加3滴酚酞指示劑,5mL0.01mol/LNaOH,于室溫下振蕩反應10min后,用0.01mol/L鹽酸標準溶液滴定至紅色消失,平行滴定3次,記錄所用HCl體積.用下式計算介質上的IDA配基密度:其中,D2.3.2CuIMAC介質上Cu3結果與討論3.1sdo含量對環(huán)氧樹脂活性密度的影響雖然史清洪等3.2ech含量對環(huán)在以DMSO為溶劑的無水反應體系中,研究了ECH含量對環(huán)氧基修飾密度的影響,結果如圖3所示.當ECH含量從10%增加到40%(?)時,環(huán)氧基密度逐步由94.1μmol/mL增大到136.7μmol/mL;進一步增加ECH含量,環(huán)氧基密度卻有所降低,這與文獻3.3活化溫度和時間對環(huán)氧基修飾密度的影響圖4表明,在40～60℃之間改變活化反應溫度,對環(huán)氧基修飾密度的影響并不是特別顯著,50℃下活化所得環(huán)氧基密度略大于40和60℃.活化反應時間對環(huán)氧基的修飾密度的影響較顯著(圖5),反應時間達4h時,所得環(huán)氧基密度最大,之后進一步延長反應時間,環(huán)氧基修飾密度呈下降趨勢.這與Matsumoto等通過上述實驗,確定環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠的最佳反應條件為:不含水的情況下,反應體系中DMSO和ECH的體積分率分別為60%和40%,NaOH用量為0.02g/mL,活化反應溫度和時間分別為50℃和4h,所得環(huán)氧基密度最高可達163.5μmol/mL,這是國內外報道通過顯微鏡對環(huán)氧基活化前后Sepharose6FF微球進行對比觀察,并未發(fā)現(xiàn)活化前后微球形態(tài)有變化.3.4基密度和密度的影響在上述優(yōu)化條件下,對約20mLSepharose6FF進行環(huán)氧化,測得環(huán)氧基密度為144.0μmol/mL,略低于優(yōu)化條件下所得的最大值(163.5μmol/mL).這是因為優(yōu)化實驗中每次活化的瓊脂糖凝膠僅為1g,反應過程中瓊脂糖凝膠的分散程度更好.利用所制的ECH-Sepharose,按圖2所示步驟依次進行IDA和Cu3.5bsa吸附和洗脫imac介質BSA在IMAC上的吸附量在pH為5～6時最大吸附在IMAC介質上的蛋白質的洗脫采用競爭性替代劑如咪唑作為洗脫劑4環(huán)氧氯丙烷活化的瓊脂糖介質(1)以DMSO為溶劑完全取代水,在無水體系中利用環(huán)氧氯丙烷對瓊脂糖凝