凍存液對多能干細胞凍存效果的影響

凍存液對多能干細胞凍存效果的影響

隨著生物實驗技術(shù)的發(fā)展，細胞外科醫(yī)學(xué)在不同的研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，其中誘導(dǎo)多能干（espc）在近年來的多能干燥劑研究中得到了廣泛應(yīng)用。iPSC是一種通過成體細胞重編程建立的多能干細胞,具有胚胎干細胞(embronicstemcells,ESC)的特性,表達ESC相關(guān)的多能性基因,能分化為3個胚層的細胞,移植到裸鼠體內(nèi)能形成畸胎瘤細胞培養(yǎng)、分離、培養(yǎng)與傳代試劑及儀器胎牛血清(fetalbovinesreum,FBS,Gibco美國),絲鏈霉素C(Mytomycin-C,Sigma美國),DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen美國),青霉素/鏈霉素(Penicillin-StreptomycinSolution,P/S,Invitrogen美國),谷氨酰胺(L-Gluatmine,L-Glu,Invitrogen美國),堿性成纖維生長因子(BasicFibroblastGrowthFactor,bFGF,Invitrogen美國),二甲亞砜(DimethylSulfoxide,DMSO,Sigma美國),神經(jīng)細胞生長添加劑(N2Supplement,Gibco美國),無血清培養(yǎng)基添加因子(B27Supplement,Gibco美國),βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin,Abeam美國,ab6160),神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GlialFibrillaryAcidicProtein,GFAP,Abeam美國,ab7260),Hoechst33342(Sigma美國,B-2261),熒光二抗(AlexaFluor488;AlexaFluor555,Invitrogen美國),封片劑(Lernerlaboratories13800美國)。60mm細胞培養(yǎng)皿(Coming美國),4孔細胞培養(yǎng)板(Corning美國),1.5mL細胞凍存管(Corning美國),ThermoHeaus培養(yǎng)箱(Thermo美國),程序降溫盒(Nalgene美國)。人成纖維細胞的分離、培養(yǎng)及傳代參考Aasen等人iPSC的誘導(dǎo)、培養(yǎng)及傳代按參考文獻人iPSC的凍存/復(fù)蘇及分組人iPSC凍存液的配比為:①含有不同配比FBS的細胞凍存液分組:A組(80%DMEM/F12培養(yǎng)液+10%FBS+10%DMSO);B組(70%DMEM/F12培養(yǎng)液+20%FBS+10%DMSO);C組(40%DMEM/F12培養(yǎng)液+50%FBS+10%DMSO);D組(90%FBS+10%DMSO);②含有不同配比DMSO的細胞凍存液分組:E組(45%DMEM/F12培養(yǎng)液+50%FBS+5%DMSO);F組(40%DMEM/F12培養(yǎng)液+50%FBS+10%DMSO);G組(35%DMEM/F12培養(yǎng)液+50%FBS+15%DMSO);H組(30%DMEM/F12培養(yǎng)液+50%FBS+20%DMSO)。將欲冷凍保存的iPSC調(diào)整到良好生長狀態(tài),使其處于對數(shù)生長期。低倍顯微鏡下采用機械切割法將iPSC集落從培養(yǎng)皿上剝離下來,移入4℃預(yù)冷的人iPSC凍存液中,每凍存管內(nèi)放置20個直徑約為400μm的細胞集落。然后將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),放入-80℃低溫冰箱中過夜,翌日再將細胞轉(zhuǎn)入液氮中做長期保存。各組細胞在凍存15d后復(fù)蘇,接種于預(yù)先已鋪上滋養(yǎng)層細胞的60mm細胞培養(yǎng)皿中做進一步培養(yǎng)。人iPSC的復(fù)蘇效率統(tǒng)計在細胞解凍培養(yǎng)10d后,統(tǒng)計形態(tài)完整且細胞未散離的人iPSC團塊數(shù)量,比較各組間細胞凍存復(fù)蘇的效率,復(fù)蘇率(%)=(回收團塊數(shù)目/冷凍團塊數(shù)目)×100%人iPSC定向分化和鑒定按參考文獻統(tǒng)計學(xué)方法各組實驗均重復(fù)3次,計數(shù)數(shù)據(jù)以不同配比凍存液對人入侵后生長狀態(tài)的影響不同配比凍存液對人iPSC復(fù)蘇效率的影響不同濃度FBS凍存液中人iPSC的復(fù)蘇率見表1,不同濃度DMSO凍存后的復(fù)蘇率見表2。值得注意的是,在解凍過程中,各組集落均有局部細胞死亡脫落,導(dǎo)致細胞團塊部分松散解離,故回收的細胞團塊在大小上有所差異,本實驗只將直徑>100μm的集落團塊列入統(tǒng)計范圍。從表1可知,含有高比例FBS凍存液的C組和D組對人iPSC的凍存復(fù)蘇保護效果最好,其復(fù)蘇率均超過了70%;對細胞凍存復(fù)蘇的保護效果顯著優(yōu)于使用較低比例FBS凍存液的A組和B組,并且A組人iPSC的復(fù)蘇率最低。表2數(shù)據(jù)表明,以F組保存效果最佳,F組凍存15d后再接種培養(yǎng)的復(fù)蘇率顯著高于E組和H組,也略高于G組,但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。綜合來看,凍存液成分為40%DMEM/F12+50%FBS+10%DMSO的F組能夠獲得最高的人iPSC凍存復(fù)蘇效率。不同配比凍存液對人iPSC復(fù)蘇后生長情況的影響各組凍存的人iPSC在復(fù)蘇后第2天即表現(xiàn)出一定的形態(tài)差異。其中,復(fù)蘇效率較低的A和E組,大部分iPSC克隆懸浮不貼壁,細胞逐漸死亡,集落發(fā)黑瓦解,而少數(shù)能貼壁生長的克隆也體積較小,生長較慢;與之對應(yīng)的是復(fù)蘇效率較高的C、D等組,復(fù)蘇細胞貼壁率高,較少有團塊整體瓦解的情況出現(xiàn),且復(fù)蘇后生長擴增的速度明顯快于A和E組;這兩種復(fù)蘇后生長狀態(tài)的差異在培養(yǎng)一段時間(約7d)后基本被消除。此外,通過觀察發(fā)現(xiàn),各組iPSC在復(fù)蘇后均保持了較典型的干細胞集落樣形態(tài),克隆內(nèi)部較為致密,邊緣界限清晰,未見明顯的分化跡象(圖1)。人iPSC復(fù)蘇后的分化能力鑒定及比較在復(fù)蘇培養(yǎng)一段時間(約20d)后,使用相同體系和方法將各組人iPSC進行定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。分別采用神經(jīng)元標記Tubulin和膠質(zhì)細胞標記GFAP,用Hoechst33342染細胞核。染色結(jié)果顯示,各組人iPSC均保留有一定的定向分化能力,可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞(圖2)。經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn),凍存液成分中含有較低濃度胎牛血清(<50%)的A組(17.33±2.08)和B組(16.00±2.65)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元的效率略高于其他組(表3)。不同濃度fbs對人民凍存復(fù)蘇的影響體外培養(yǎng)細胞凍存復(fù)蘇后的效率和生長狀態(tài)直接影響后續(xù)各項生物學(xué)實驗的結(jié)果,其與細胞凍存前的狀態(tài)、凍存保護劑的種類和濃度、凍存復(fù)蘇方法以及凍存液中FBS的濃度等因素均有密切關(guān)系在凍存細胞時要加入保護劑,如果將細胞直接冷凍,細胞內(nèi)外的水份會在很短時間內(nèi)形成冰晶,引起細胞核內(nèi)DNA斷裂、蛋白質(zhì)溶解和細胞器損傷等一系列不良反應(yīng)本研究采用含有不同DMSO濃度的凍存液對iPSC在液氮中凍存進行保護,復(fù)蘇后接種培養(yǎng),觀察其生長情況并測定相應(yīng)的細胞復(fù)蘇率。結(jié)果顯示,含有10%濃度DMSO的凍存液對iPSC的凍存保護效果最佳,濃度為10%DMSO凍存15d后再接種培養(yǎng)的iPSC復(fù)蘇率明顯高于5%和20%DMSO組,也高于15%DMSO組。經(jīng)分析,當DMSO濃度較低(5%)時,不能有效阻止細胞內(nèi)形成冰晶,凍存過程將對細胞造成較大損傷;而當DMSO濃度增至20%時,細胞復(fù)蘇率也明顯下降,這可能與高濃度的冷凍保護劑會引起較高滲透壓有關(guān)。所以,本研究結(jié)果表明濃度為10%DMSO凍存液對長期凍存iPSC有更好的保護作用。血清亦是細胞凍存液的重要組成部分,不同細胞株對其含量要求有所不同,原則上是既要保證凍存復(fù)蘇之后細胞生長所需的量,又不至于浪費。本研究同時探討了不同濃度FBS對iPSC凍存復(fù)蘇效率的影響。鑒于含有50%FBS和90%FBS凍存液的復(fù)蘇效率相當,故從經(jīng)濟上考量,本研究采用凍存液中含50%FBS的配比來進一步開展凍存液中含有不同濃度DMSO的復(fù)蘇率比較實驗。從結(jié)果中可以看出,當50%FBS和90%FBS濃度時,iPSC的凍存復(fù)蘇效率最高,均顯著高于FBS含量較低的其他實驗組。其呈現(xiàn)出一個變化趨勢:當FBS含量低于50%時,FBS濃度越高,凍存復(fù)蘇率也越高,即復(fù)蘇效率與血清濃度呈正相關(guān);但當FBS含量高于50%時,濃度的變化對iPSC凍存復(fù)蘇效果的影響就不明顯了。因此,綜合考慮培養(yǎng)效果及經(jīng)濟角度,使用含有50%FBS的凍存液即可滿足iPSC凍存復(fù)蘇的要求。iPSC之所以被認為具有類似于ESC的特征,關(guān)鍵在于兩者都具有發(fā)育的多能性,即可分化為多種功能細胞為觀察這一現(xiàn)象,本研究采用免疫組化學(xué)方法來鑒定各種凍存液對人iPSC凍存復(fù)蘇后向神經(jīng)細胞定向分化能力的影響。實驗結(jié)果表明,本研究中的幾種凍存體系均能保持人iPSC的定向分化能力,但比較各組間神經(jīng)元的得率發(fā)現(xiàn),凍存液成分中血清濃度較低時,復(fù)蘇的iPSC定向分化能力更強。這可能正是因為高濃度的血清誘導(dǎo)了干細胞的自主分化,降低了未分化細胞的比例。此外,以下一些因素也有可能導(dǎo)致干細胞在凍存復(fù)蘇過程中自主分化:①凍存過程導(dǎo)致胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和細胞器損傷,改變了干細胞原有的遺傳信息,影響了干細胞的增殖和發(fā)育方向;②凍存過程中部分細胞死亡導(dǎo)致細胞團塊變小或細胞離散,致使干細胞不能保持其特有的集落形態(tài)以對抗培養(yǎng)環(huán)境中的分化因素,無法維持在未分化狀態(tài)iPSC因能夠在體外無限擴增,被認為是大量獲取干