病毒載量檢測方法及其意義

病毒載量檢測方法及其意義第1頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月病毒載量（viralload）代表的是病毒的負(fù)荷，即體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量。實際上，體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量是不能直接測量的，一般用每毫升血漿中HIVRNA的拷貝數(shù)代表HIV的病毒載量。第2頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月一、通常的病毒載量測定方法bDNA方法(分枝DNA雜交試驗)NASBA(核酸序列擴(kuò)增試驗)CobasAmplicorHIV-1Monitor(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))熒光定量PCR第3頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月bDNA是一種夾心式的核算雜交反應(yīng)過程，用于直接定量檢測血漿中HIV-1RNA的含量。首先，通過離心將血漿中的HIV-1富集起來。HIV-1病毒基因組RNA從病毒顆粒中釋放出來后，首先會被一組合成的寡核苷酸探針又稱捕獲探針?biāo)Y(jié)合并連接在微孔板上，然后通過另外一些靶定探針使病毒RNA與預(yù)放大探針結(jié)合。捕獲探針包括十七個可與基因組特異結(jié)合的捕獲位，靶定探針包括81個可與基因組特異結(jié)合的靶定區(qū)，分別靶定在病毒RNApol基因的不同區(qū)段。放大探針結(jié)合到預(yù)防大探針上，從而形成支鏈DNA復(fù)合體。隨后多拷貝的堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的探針與該復(fù)合體雜交結(jié)合。與化學(xué)發(fā)光底物共同孵育，所產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣品中HIV-1RNA的量成正比，以相對光強(qiáng)度單位（RLUs）表示的光度值被分析系統(tǒng)記錄下來，試劑盒中含有已知濃度的經(jīng)β-丙內(nèi)酯（BPL）處理的HIV-18E5/LAV病毒液作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的光吸收值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中HIV-1RNA的量可對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

擴(kuò)增HIV-1M組的A-H亞型。第4頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月本實驗系統(tǒng)檢測的定量范圍為50至500,000HIV-1RNA拷貝/ml。檢測結(jié)果以如下形式報告：低于最低定量限的值報告為“<50”HIV-1RNA拷貝/毫升。在最低定量限和最高定量限之間的值報告為實際檢測值。高于最高定量限的值報告為“>500,000”HIV-1RNA拷貝/毫升。高于500,000HIV-1RNA拷貝/毫升的樣本位于檢測的最高定量限以上，必須適當(dāng)稀釋以獲得確切的量值。在人血漿中稀釋高濃度樣本，稀釋用血漿需經(jīng)VERSANTHIV-1RNA3.0Assay(bDNA)檢測鑒定不含HIV-1RNA，按照實驗流程重新檢測，得出的結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)以確定初始樣本的病毒載量。第5頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月

COBASAMPLICORHIV-1MONITOR實驗包括以下步驟：樣本制備靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA用HIV-1特異互補(bǔ)引物進(jìn)行靶cDNAPCR擴(kuò)增通過比色進(jìn)行與探針結(jié)合的擴(kuò)增產(chǎn)物的測定第6頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月COBASAMPLICORHIV-1MONITOR試劑對HIV-1病毒RNA的定量檢測是采用HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品來完成的。HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品是包括作為HIV-1靶RNA引物結(jié)合部位和HIV-1擴(kuò)增子單一探針結(jié)合區(qū)的非感染性RNA轉(zhuǎn)錄物。將已知拷貝數(shù)的HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品加到每一個樣本中和HIV-1靶序列一起共同進(jìn)行樣本制備、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、雜交和檢測。COBASAMPLICOR分析儀根據(jù)HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)計算每一個樣本的HIV-1RNA的含量。可擴(kuò)增HIV-1M組的A-H基因亞型。第7頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)試驗：能夠定量400-750000拷貝/毫升的HIVRNA，需要0.2毫升血漿。超敏試驗：能夠定量50-75000拷貝/毫升的HIVRNA,需要0.5毫升血漿。第8頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月NucliSensEasyQHIV-1實驗是使用NASBA技術(shù)的靶擴(kuò)增試驗。NASBA技術(shù)選擇性地直接擴(kuò)增RNA而沒有PCR步驟，用2個寡核苷酸引物、3個酶、三磷酸脫氧核苷和合適的緩沖液進(jìn)行一步夾心雜交。首先用異硫氰酸胍和氧化硅顆粒提取高純度RNA，RNA通過重復(fù)的合成和轉(zhuǎn)錄雙鏈DNA中間體得到擴(kuò)增。在AMV-RT的作用下，HIV-1gag區(qū)的引物P1介導(dǎo)由標(biāo)本RNA合成cDNA，RNA鏈被RNAse降解。引物P2結(jié)合啟動第二條DNA鏈合成，反義RNA通過T7多聚酶啟動雙鏈DNA合成，這個循環(huán)不斷重復(fù)，使得靶RNA在等溫條件下大量擴(kuò)增100萬到1000萬倍，然后直接用化學(xué)發(fā)光法確定核酸量，通過HIV特異的gag和pol區(qū)的3個內(nèi)標(biāo)同時擴(kuò)增而達(dá)到定量目的。它具有高度敏感性和廣闊的動態(tài)范圍。最近NucliSensHIV-1定量實驗有了較大改進(jìn)，將NASBA核酸擴(kuò)增技術(shù)與實時(real-time)檢測技術(shù)結(jié)合起來,能夠?qū)z測進(jìn)行實時監(jiān)控。結(jié)果表達(dá)方式由每毫升標(biāo)本的拷貝數(shù)（cp/ml）改變?yōu)槊亢辽龂H單位（IU/ml）。

可擴(kuò)增HIV-1M組的A-G亞型。

第9頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月NucliSens核酸分析系統(tǒng)利用三項技術(shù)：專利的BOOM核酸提純技術(shù):手工manual

半自動miniMAG

自動easyMAG“擴(kuò)增RNA”的NASBA技術(shù)使用熒光分子信標(biāo)（molecularbeacon)對擴(kuò)增產(chǎn)物的實時檢測技術(shù)第10頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月三種病毒載量檢測技術(shù)比較廠家bioMerieuxRocheSimens(Bayer)商品名NuclisensEasyQCOBASAmplicorHIV-1Monitor1.5Versant3.0擴(kuò)增和檢測原理擴(kuò)增：NASBA檢測：RealTime.MolecularBeacon實時擴(kuò)增檢測擴(kuò)增：RT-PCR檢測：底物顯色先擴(kuò)增再檢測無需擴(kuò)增：bDNA分枝信號放大系統(tǒng)檢測：化學(xué)發(fā)光先雜交，再檢測線性范圍50-3,000,000IU/ml(v1.1)線性范圍廣，無需稀釋標(biāo)本重復(fù)檢測，報告國際單位，易于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)25-10,000,000IU/ml(v2.0)普通方法：400-750,000Copies/ml超敏方法：50-75,000Copies/ml線性范圍有限，高濃度樣本需稀釋檢測，超敏方法需要用低溫超速離心機(jī)離心1個小時50-500,000Copies/ml核酸提取硅膠固相吸附異硫氰酸胍裂解，提純效率高，核酸純度高，操作可見可與全自動核酸提取儀配套使用，提純效率高，操作簡便異丙醇沉淀異硫氰酸胍裂解，沉淀物不可見，易引起操作誤差，異丙醇化學(xué)毒性標(biāo)本只使用EDTA抗凝血漿不需純化核酸異硫氰酸胍裂解標(biāo)本只使用于EDTA抗凝血漿第11頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月廠家bioMerieuxRocheSimens(Bayer)擴(kuò)增NASBA適用RNA,等溫擴(kuò)增無需溫度循環(huán)，產(chǎn)物為RNA,全程在單一密封管內(nèi)進(jìn)行，無污染問題。在擴(kuò)增的同時進(jìn)行檢測，效率高RT-PCR產(chǎn)物為DNA，易發(fā)生污染，對實驗室區(qū)域劃分嚴(yán)格bDNA不對目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，只進(jìn)行信號放大檢測分子信標(biāo)實時檢測熒光信號，敏感性高，檢測范圍廣辣根過氧化物酶標(biāo)記檢測探針，TMB底物顯色用樣品OD值和定標(biāo)物OD值的比值計算結(jié)果，需要稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測范圍小，并且受酶活性、底物氧化顯色的影響各級探針與被檢物核酸雜交，檢測發(fā)光信號強(qiáng)弱雜交孵育時間長，需要16個小時標(biāo)本數(shù)量每次檢測8的整數(shù)倍標(biāo)本直至48個不需要陰陽性對照每次檢測12或24個標(biāo)本需要設(shè)一個陰性、一個弱陽性和一個強(qiáng)陽性對照每次檢測12的整數(shù)倍標(biāo)本需設(shè)一個陰性、一個弱陽性和一個強(qiáng)陽性對照試劑盒包裝48人份/盒每次試驗8人份分裝獨立包裝，長期穩(wěn)定48人份/盒每次試驗12人份分裝一旦打開試劑盒，需要在1個月內(nèi)使用完48人份，否則試劑失效192人份/盒每次試驗12人份分裝工作效率6.5小時48份標(biāo)本8小時24份標(biāo)本48小時192份標(biāo)本第12頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月二、病毒載量檢測的意義早期診斷嬰兒的早期診斷：感染HIV的母親所生嬰兒小于18個月時，不能按照常規(guī)檢測程序進(jìn)行抗體檢測來確證是否感染了HIV。這種情況下，采集嬰兒不同時間的樣本進(jìn)行HIV核酸檢測。也可使用集合法對采供血機(jī)構(gòu)的原料血漿及HIV抗體陰性的高危人群樣品進(jìn)行核酸檢測，及時發(fā)現(xiàn)窗口期感染者，降低“殘余危險度”，預(yù)防傳播。第13頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月疑難樣本的輔助診斷在感染早期或疾病終末期出現(xiàn)抗體不確定反應(yīng)時，RNA的測定結(jié)果可幫助提供HIV感染早期或終末期的證據(jù)。但在一般情況下，抗體檢測足以對HIV感染與否作出正確診斷。第14頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月病程監(jiān)控及預(yù)測

HIV感染后病毒載量的變化具有一定的規(guī)律，這種變化與疾病的進(jìn)程密切相關(guān)。定期進(jìn)行病毒載量檢測有助于確定疾病發(fā)展的階段，以確定相應(yīng)的治療方案。HIV病毒載量與6年發(fā)病率的關(guān)系：病毒載量(拷貝/毫升)6年發(fā)病率（%）<5005.4501-300016.63001-1000031.710001-3000055.2>3000080第15頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月指導(dǎo)抗病毒治療及療效判定通常在病毒載量達(dá)到一定水平后（如>35000-50000拷貝/毫升）抗病毒治療才顯示良好的治療效果。治療后通過病毒水平的檢測能夠確定治療是否有效。理想的結(jié)果是治療24周后，病毒水平會控制在檢測線以下。第16頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月.耐藥性監(jiān)測可用于HIV耐藥性檢測和監(jiān)測。治療后病毒載量得不到有效控制時被認(rèn)為治療失敗。引起治療失敗的原因之一是病毒對治療藥物的敏感性降低或不敏感，也就是產(chǎn)生了耐藥。對病毒載量>1000拷貝/毫升的樣本進(jìn)行耐藥性檢測對臨床醫(yī)生修改治療方案有一定的幫助。第17頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月三、影響病毒載量測定結(jié)果的因素

樣本類型：血漿和血清標(biāo)本都可用來測定病毒載量，但是血清的檢測結(jié)果大約是血漿的50%（30-80%），可能是因為血液凝固的過程中HIV顆粒被包裹在纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中，導(dǎo)致血清中病毒的濃度下降。因此，測定病毒載量應(yīng)該首選血漿標(biāo)本，血漿也是臨床使用的唯一標(biāo)本。血清標(biāo)本對于研究也是可以接受的，重要的是每位病人使用的標(biāo)本類型應(yīng)始終保持一致。第18頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月抗凝劑：抗凝劑能夠顯著影響測定的結(jié)果。肝素鈉處理的血漿不適合做AmplicorHIV-1Monitor試驗，因為肝素是PCR反應(yīng)的一個潛在的抑制劑。如果必須用RT-PCR方法測量肝素處理的血漿，可以向標(biāo)本中加入肝素酶以分解肝素。另外，肝素處理的血漿中病毒顆粒降解的速率顯著高于EDTA鈉鹽和枸櫞酸鈉處理的血漿，一般情況下不同抗凝劑處理的血液6小時之內(nèi)HIVRNA的降解速率分別是1.8%/小時（EDTA）、3.3%/小時（枸櫞酸鈉）和5.0%/小時（肝素）。在血液處理方法相同的條件下，用EDTA鈉鹽抗凝的血漿結(jié)果顯著優(yōu)于枸櫞酸鈉和肝素，因此EDTA鈉鹽是首選的抗凝劑。第19頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)本處理時間：HIV-1在體內(nèi)進(jìn)行快速轉(zhuǎn)換，平均半衰期是大約6個小時。HIV-1在體外未處理的全血中也快速降解，全血中HIVRNA的降解速率在6小時之內(nèi)平均是9%（0.04log）,最大的降解速率是在采血以后6-8小時，采血以后30小時內(nèi)可能減少0.5log。因此為了減少病毒顆粒降解對檢測的影響，應(yīng)該在采血以后6小時之內(nèi)分離血球和血漿。

第20頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月樣品的保存溫度：-70℃室溫凍融3次，HIVRNA變化的幅度小于0.2log。-70℃保存5個月，HIVRNA減少0.3-0.5log。保存12個月，HIVRNA減少一般不超過0.4log.血漿在室溫或4℃保存3天，HIVRNA減少不超過0.5log。-20℃保存2-3年，病毒載量大約減少50%左右。反復(fù)凍融影響更大。第21頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月四、病毒載量測定結(jié)果的分析和解釋

分析一個病人不同時間病毒載量測定的結(jié)果時，首先要考慮測定結(jié)果的變化是真實的生物學(xué)改變還是方法本身的變異或誤差。病毒載量的變化超過0.5log（大約是3倍）就超過了實驗和每日的正常變化，應(yīng)被視為有生物學(xué)意義的變化，而0.5log以內(nèi)的變化就很難與隨機(jī)的變異相區(qū)分。特別需要注意的是在接近檢測下限的時候，實驗的變異對于解釋病毒載量變化的意義有更大的影響。例如，病毒載量從50cp/ml增加到150cp/ml，雖然變化的幅度達(dá)到0.5log，但真正反映的可能是實驗的變異而不是抗病毒治療的失敗，因此對于接近檢測下限的測定結(jié)果需要進(jìn)行認(rèn)真分析。第22頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月五、病毒載量測定的質(zhì)量管理

質(zhì)量保證質(zhì)量保證指從接收樣品到發(fā)出報告的整個過程中，為確保最終結(jié)果的正確性所采取的全部措施。質(zhì)量控制制定和實施質(zhì)量控制計劃之前首先要對使用的方法和系統(tǒng)進(jìn)行深入的了解，包括方法的檢出限、偏性、誤差被接受和拒絕的統(tǒng)計學(xué)水平。質(zhì)量控制包括3個部分：對照（control）、程序（Procedure）和規(guī)則（rules）。質(zhì)量評價可以用已知HIVRNA濃度的血漿樣品進(jìn)行外部質(zhì)量評價。對質(zhì)量評價樣品的要求是：（1）覆蓋檢測的動態(tài)范圍，一般要求5個log。（2）重復(fù)測定同一份樣品考察精密度。（3）包含HIV-1不同亞型的樣品。

第23頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月六、樣本采集及分裝注意事項樣本采集：用EDTA抗凝管采集樣本5ml，立即顛倒混勻8-10次，避免溶血。按照要求編號。樣本分裝：處理樣本時戴一次性無粉手套。核對樣本編號及數(shù)量。2-6個小時之內(nèi)用普通離心機(jī)3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘分離血漿（一定要保證足夠的離心時間）。用去RNA酶的帶濾芯吸頭吸出血漿，分裝到兩個已編號的去RNA酶的螺口管中，每管1.1-1.2ml。編號要清晰。項目樣本按照項目要求編號；只做病毒載量檢測的樣本應(yīng)編抗病毒治療號。第24頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月七、樣本的儲存：近幾天需要檢測的血漿可放于2-8℃3個月以內(nèi)檢測的血漿可放于-20℃需長期保存的（3個月以上的）血漿可放置-80℃以下冰箱凍存。第25頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月八、樣本的運輸在冷凍狀態(tài)下送樣。樣本按照編號順序放在凍存盒里，蓋子上及盒子邊上寫明是哪個點的什么樣本（比如說是哪個項目樣本）以及樣本的數(shù)量。第一份樣本處要有明顯的標(biāo)示如箭頭等。凍存盒放入專用送樣箱里，送樣箱應(yīng)易于消毒處理。在凍存盒周圍應(yīng)墊有吸水材