化妝品用化學(xué)原料體外熒光素滲漏試驗(yàn)方法

化妝品用化學(xué)原料體外熒光素滲漏試驗(yàn)方法1范圍本方法規(guī)定了化妝品用化學(xué)原料體外熒光素滲漏試驗(yàn)方法的范圍、試驗(yàn)?zāi)康?、術(shù)語和定義、試驗(yàn)原理、試驗(yàn)材料與試劑、試驗(yàn)步驟、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。本方法適用于化妝品用水溶性化學(xué)原料眼刺激/腐蝕性的檢測。2試驗(yàn)?zāi)康念A(yù)測和評價化妝品用水溶性化學(xué)原料對眼睛是否具有刺激作用或腐蝕作用。3術(shù)語和定義略4試驗(yàn)原理以在嵌入型細(xì)胞培養(yǎng)皿（transwell）內(nèi)單層培養(yǎng)的致密犬腎細(xì)胞（MDCK）來模擬眼角膜上皮細(xì)胞的屏障結(jié)構(gòu)，通過檢測暴露于受試物后的MDCK細(xì)胞模型對熒光素鈉的滲漏率，來判斷MDCK細(xì)胞模型的屏障破壞程度，進(jìn)而預(yù)測和評估受試物的眼刺激/腐蝕性。5試驗(yàn)材料與試劑5.1細(xì)胞株采用犬腎細(xì)胞MDCK，該細(xì)胞為貼壁生長。要求：來源清晰，代數(shù)明確（<30代）。5.2培養(yǎng)基本方法采用不含酚紅的DMEM-F12（1：1）混合培養(yǎng)液，培養(yǎng)液加入10%胎牛血清（FBS）和適量抗生素（終濃度為青霉素50～100IU/mL，鏈霉素50～100μg/mL）。5.3溶液的配制0.01%（w/v）熒光素鈉溶液：稱取50mg熒光素鈉，溶解于500mL不含酚紅的HBSS溶液中，室溫避光保存。100mg/mL月桂醇聚氧乙烯醚（Brij-35，CAS9002-92-0）溶液：稱取100mgBrij-35，溶解于1mL不含酚紅的HBSS溶液中，可以37℃水浴或超聲10min以內(nèi)的方式助溶。5.4溶劑的選擇本方法溶劑為不含酚紅的HBSS緩沖液，受試物應(yīng)在HBSS中以≥250mg/mL的濃度溶解（至少滿足一個劑量≥100mg/mL）；若受試物在HBSS中的溶解度<100mg/mL，且測出FL20<100mg/mL時，試驗(yàn)條件仍成立。當(dāng)受試物無法滿足上述溶解條件時，不適用于本方法。5.5受試物的濃度選擇及配制受試物濃度梯度首選1、25、100、250mg/mL、原液或飽和溶液五個濃度作為濃度梯度進(jìn)行檢測，若受試物為固體，最高濃度首選750mg/mL。如果細(xì)胞毒性出現(xiàn)在濃度25~100mg/mL之間，則需要追加濃度梯度為：1、25、50、75、100mg/mL的測試；如果細(xì)胞毒性低于1mg/mL，則需追加濃度梯度為：0.01、0.1、0.25、1、10mg/mL的測試。受試物應(yīng)在染毒前30min內(nèi)新鮮配制，否則必須證實(shí)儲存不影響其穩(wěn)定性。可采用升溫或超聲助溶，超聲時間為10min以內(nèi)，如升溫助溶，需注意室溫下所有濃度的受試物溶液需保持溶液或混懸液狀態(tài)。5.6對照的選擇實(shí)驗(yàn)應(yīng)同時設(shè)空白對照、陰性對照和陽性對照。以不種細(xì)胞的transwell模型加溶劑（不含酚紅的HBSS或礦物油）作為空白對照；MDCK細(xì)胞模型以溶劑（不含酚紅的HBSS或礦物油）作為陰性對照，以100mg/mLBrij-35溶液作為陽性對照。6試驗(yàn)步驟6.1細(xì)胞建模6.1.1細(xì)胞復(fù)蘇6.1.2接種細(xì)胞于含10%胎牛血清且不含酚紅的DMEM-F12（1：1）混合培養(yǎng)液中，每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，穩(wěn)定傳2代后準(zhǔn)備建模。6.1.3用胰酶-EDTA（0.05%w/v胰酶，0.02%w/vEDTA）消化細(xì)胞，收集細(xì)胞于離心管中，800～1000rmp/min離心5min，重新懸浮細(xì)胞于培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105/mL。6.1.4取無菌24孔板每孔加入400μl新鮮培養(yǎng)基，將嵌入型細(xì)胞培養(yǎng)皿transwell（嵌入型細(xì)胞培養(yǎng)皿厚度為80-150μm，孔徑約0.45μm）放入24孔板中，注意避免氣泡。其中21個transwell內(nèi)室中加入400μl細(xì)胞懸液（終濃度約1.6×105個/transwell），剩余3個transwell中加入同體積的培養(yǎng)液。將24孔板放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后，檢測前一天transwell內(nèi)外換新鮮培養(yǎng)液。6.2染毒和清洗以400μl/孔預(yù)熱至37℃的HBSS（無酚紅）清洗transwell內(nèi)室2遍。以200μl/孔的受試物濃度梯度溶液進(jìn)行染毒，染毒時間為1min，每個濃度做3個復(fù)孔，染毒后以400μl/孔預(yù)熱至37℃的HBSS（無酚紅）清洗transwell內(nèi)室2遍。同時空白對照、陰性對照和陽性對照做相應(yīng)的處理。染毒圖示見表1。MMMBBBPPPT1T1T1T2T2T2T3T3T3T4T4T4T5T5T5表1樣品染毒示意圖注：M：僅有transwell，不加細(xì)胞B：種了細(xì)胞的transwell，加陰性對照（不含酚紅的HBSS或礦物油）P：種了細(xì)胞的transwell，加陽性對照（100mg/mLBrij-35溶液）T1-T5：種了細(xì)胞的transwell，加配制好的受試物濃度梯度工作液，T1代表最低濃度，T5代表最高濃度6.3熒光素滲漏率測定及計(jì)算6.3.1熒光素滲漏率測定：取新的24孔板，每孔中加入400μLHBSS（無酚紅）溶液，將上述清洗后的transwell對應(yīng)放入新的24孔板中，transwell內(nèi)室加入400μL0.01%熒光素鈉溶液，注意避免熒光素鈉溶液直接進(jìn)入transwell室外的孔中，室溫避光靜置30min，然后從24孔板中移除transwell，移除時需避免transwell內(nèi)室中多余的熒光素鈉溶液進(jìn)入24孔板。在多功能酶標(biāo)儀中測定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長530nm)。根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算熒光素滲漏率FL。其中：m：三個重復(fù)測量的平均熒光強(qiáng)度；x：最大熒光素滲漏的平均熒光強(qiáng)度（M組）；y：0%熒光素滲漏的平均熒光強(qiáng)度（B組）。6.3.2FL20計(jì)算：根據(jù)受試物各濃度FL的結(jié)果，計(jì)算FL20。其中：B：熒光素滲漏率<20%；C：熒光素滲漏率>20%；MC：C對應(yīng)的濃度(mg/ml)；MB：B對應(yīng)的濃度(mg/ml)。6.4結(jié)果判定當(dāng)受試物FL20（mg/mL）≤100mg/mL時，判定受試物具有眼腐蝕性或強(qiáng)刺激性。6.5試驗(yàn)體系的質(zhì)控（1）0%熒光素滲漏值（B組）平均數(shù)應(yīng)小于等于最大熒光素滲漏值（M組）平均數(shù)的6%；（2）