6-6-氯-3-基-5-羥基己酸叔丁酯s-hoh的合成及應(yīng)用

6-6-氯-3-基-5-羥基己酸叔丁酯s-hoh的合成及應(yīng)用

tali活性物質(zhì)是近年來開發(fā)的最成功的降血脂藥物，在2016年的10家藥物銷售名單中占2%。(S)-6-氯-3-羰基-5-羥基己酸叔丁酯[(S)-CHOH]是他汀類藥物的關(guān)鍵手性砌塊,可用于合成阿托伐他汀鈣(立普妥)和瑞舒伐他汀鈣(可定)等。目前合成(S)-CHOH的方法有很多,其中氯酯路線已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化本研究從LkTADH出發(fā),首先通過對其進(jìn)行回復(fù)突變確定關(guān)鍵位點,接著對關(guān)鍵位點進(jìn)行飽和突變,并對酶活提高的位點進(jìn)行組合,獲得酶活最高的突變體M1材料和方法1.1質(zhì)粒提取和合成PrimeSTARue3ebMAXDNAPolymerase和DpnI限制性內(nèi)切核酸酶購自大連TaKaRa公司。質(zhì)粒DNA小量制備試劑盒,DNA凝膠回收試劑盒均購自杭州AxygenBiotechnology公司?？敲顾?kan)和異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。CDOH和(S)-CHOH由本實驗室合成(后CDOH購自杭州楊德醫(yī)藥科技有限公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1.2dpni檢驗?zāi)０逶O(shè)計含有突變氨基酸的PCR引物,以pET30-LkTADH質(zhì)粒為模板進(jìn)行全質(zhì)粒PCR,PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析后用DpnI酶消化質(zhì)粒模板,消化產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài),涂布于含有卡那霉素的抗性平板上,過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行測序。1.3接種量的培養(yǎng)將構(gòu)建好的突變體在含有kan的LB固體平板上劃出單菌落,挑取單菌落接種于裝有5ml含有50μg/mlkan的LB培養(yǎng)基中,37℃、200r/min培養(yǎng)8h,以2%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)入50ml含有50μg/mlkan的LB培養(yǎng)基中,37℃、200r/min培養(yǎng)2~3h至吸光度OD1.4不同濃度的cdhs反應(yīng)產(chǎn)物(S)-CHOH的濃度檢測采用HPLC方法。4000r/min下離心15min,收獲菌體,全細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)體系為1mlpH為5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉-NaOH緩沖液,10mmol/L的CDOH[預(yù)溶于50%(V)異丙醇],終濃度為1mmol/L的NADPH,加入適量的細(xì)胞懸浮液后于金屬浴中30℃、600r/min振蕩反應(yīng)20min,反應(yīng)液離心(8000r/min、5min),收集上清過濾后待HPLC檢測(每個反應(yīng)做3個重復(fù))(控制轉(zhuǎn)化率在10%以內(nèi))。酶活單位(U)定義為:在所述條件下,每分鐘產(chǎn)生1μmol(S)-CHOH所需的酶量。酶活計算公式如下:式中,X1.5突變酶的動態(tài)參數(shù)測定反應(yīng)體系為1ml,在pH5.5檸檬酸-Na采用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的曲線擬合計算出相應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)。1.6基于源研究和分子匹配搜索蛋白質(zhì)PDB數(shù)據(jù)庫,獲得醇脫氫酶LkADH2結(jié)果討論2.1返回突發(fā)模式確定的重要點2.1.1回復(fù)突變體的構(gòu)建為深入探究LkTADH4個突變位點對酶活的影響,以pET30-LkTADH為模板進(jìn)行回復(fù)突變,構(gòu)建一系列回復(fù)突變體(表1)。突變體全質(zhì)粒PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖核酸電泳分析結(jié)果如圖2所示,得到約6200bp的目的條帶,大小與理論值相符,同時序列測定結(jié)果也正確。將構(gòu)建好的突變體進(jìn)行表達(dá),突變酶的表達(dá)情況基本一致,如圖3a所示,典型突變體LkTADH、M2.1.2關(guān)鍵因素的確定如表2所示,兩點突變體M基于上述分析比較,選取突變體LkTADH、M2.2重要點的飽和突變?yōu)檫M(jìn)一步提高酶活,以M2.3多元動態(tài)分析為深入研究突變點的作用機(jī)制,以CDOH為底物分別