替加環(huán)素雜質(zhì)9-硝基米諾環(huán)素在組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌中的致突變試驗

替加環(huán)素雜質(zhì)9-硝基米諾環(huán)素在組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌中的致突變試驗

用硫加環(huán)素（圖1）是甘氨酸四環(huán)素中的第一個藥物。這是一種四環(huán)素類廣譜抗生素。它具有廣譜抗菌活性和低劑量的特點。這是治療臨床上各種藥物感染的藥物。替加環(huán)素是以鹽酸米諾環(huán)素為反應(yīng)起始物料，經(jīng)第一步硝化反應(yīng)生成9-硝基米諾環(huán)素（9-nitrominocycline，圖2),9-硝基米諾環(huán)素在氫化工序作為原料反應(yīng)，在后續(xù)步驟去除，但仍可能存在殘留。因9-硝基米諾環(huán)素的結(jié)構(gòu)中含芳香硝基，為基因毒性警示結(jié)構(gòu)，即使少量的殘留仍可能存在用藥安全隱患，因此，確認(rèn)9-硝基米諾環(huán)素是否具有基因毒性，對制定合理的控制限度非常關(guān)鍵。通過Toxnet/ECHA、Derek、Toxtree軟件，對9-硝基米諾環(huán)素進(jìn)行分析，結(jié)果提示該雜質(zhì)為基因毒性雜質(zhì)（2類），基因毒性警示結(jié)構(gòu)為芳香硝基。研究采用二甲基亞砜作為溶劑，通過鼠傷寒沙門氏菌體外回復(fù)致突變試驗（Ames試驗），對其進(jìn)行分析評估，為安全用藥提供參考。1材料和方法1.1實驗設(shè)備實驗用儀器詳見表1。1.2實驗材料1.2.1測試試劑實驗用試劑詳見表2。1.2.2試驗藥物9-硝基米諾環(huán)素（來源：公司自制，批號：2123-180801-P)1.2.3不同規(guī)格的ta98、ta53實驗菌株為組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97a（批號：5147D);TA98（批號：5268D);TA100（批號：5204D);TA102（批號：5216D);TA1535（批號：5189D），詳見表3。菌株由Moltox提供，于2℃～8℃保存。1.2.4代謝激活系統(tǒng)s9來源美國MolTox公司，規(guī)格為5ml/瓶，批號為3863。1.2.5供試品溶液配制供試品配制：稱取受試物9-硝基米諾環(huán)素12.6mg，溶于250μlDMSO中（水中易降解），震蕩混勻后按比例稀釋，至少6個劑量組，供試品溶液使用當(dāng)天配制。陽性藥物配制：除甲基磺酸甲酯為液體及敵克松為水溶外，其他陽性藥物均使用DMSO配制成相應(yīng)的濃度，絲裂霉素，4-硝基-O-鄰苯二胺和2-氨基蒽均配制成終濃度為1mg/ml的溶液，2-氨基芴分別配制成1mg/ml和10mg/ml的溶液，敵克松用無菌水配制成2.5mg/ml的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.2.6培養(yǎng)基的制備(1)磷酸鹽儲備液：稱取磷酸氫鈉銨（NaNH(2)40%葡萄糖溶液：稱取葡萄糖40g，加蒸餾水100ml。4℃冰箱保存。(3)0.5mmol/L生物素-組氨酸溶液：稱取D-生物素（相對分子量244)30.5mg,L-組氨酸（相對分子量155)19.4mg，加蒸餾水250ml。4℃冰箱保存。(4)MgCl(5)10%S9混合液的配制：稱取葡萄糖-6-磷酸，14.11mg，氧化型輔酶Ⅱ30.6mg,MgCl(6)LB培養(yǎng)基：稱取酵母抽提物0.5g，大豆蛋白胨1g,NaCl1g，蒸餾水100ml,121℃滅菌20min;LB固體培養(yǎng)基，在上述基礎(chǔ)上增加1.5g的瓊脂粉。(7)底層培養(yǎng)基：稱取瓊脂粉2g，磷酸鹽儲備液2ml,40%葡萄糖溶液5ml，蒸餾水100ml，充分混勻，0.103MPa滅菌15min。(8)頂層培養(yǎng)基：稱取瓊脂糖0.6g,NaCl0.5g，組氨酸-生物素溶液（0.5mmol/L)10ml，蒸餾水100ml；充分混勻，0.103MPa滅菌15min，于45℃水浴中保溫。注：對于菌株TA1535,TA100，頂層培養(yǎng)基中組氨酸-生物素溶液需加10ml,TA97a,TA98和TA102，頂層培養(yǎng)基中組氨酸-生物素需加3ml。1.3化療前后s9的制備Ames試驗選用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535為指示菌，采用平皿滲入法進(jìn)行。底層平板，每個平皿倒10ml底層培養(yǎng)基，每個劑量及各個對照組加和不加S9均平行做3個平板。在無菌帶帽5mlEP管中分別加入稀釋過的菌液0.1ml，實驗組加受試物20μl，未處理對照組加生理鹽水20μl，陽性對照組加入相應(yīng)的陽性藥（見表4），溶媒對照組加入相應(yīng)的溶媒（一般為DMSO,20μl），不需要活化時再加入500μl的生理鹽水，需要活化時應(yīng)加入S9混合液500μl，之后加入頂層培養(yǎng)基2ml，混勻，迅速傾入鋪好底層培養(yǎng)基的平板上，轉(zhuǎn)動平板使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層培養(yǎng)基上，平放固化，37℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，必要時延長至72h觀察結(jié)果。經(jīng)實驗，9-硝基米諾環(huán)素在DMSO和水中于250mg/ml(5000μg/皿）時均可溶，但在預(yù)實驗中，9-硝基米諾環(huán)素對于TA102和TA97a菌株在250mg/ml(5000μg/皿），125mg/ml(2500μg/皿），62.5mg/ml(1250μg/皿）時均表現(xiàn)出抑菌作用，對于TA98和TA100菌株在250mg/ml(5000μg/皿），125mg/ml(2500μg/皿），62.5mg/ml(1250μg/皿）及31.25mg/ml(625μg/皿）時表現(xiàn)出抑菌作用，依據(jù)ICHS2(R1）和藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則2實驗系統(tǒng)的驗證本實驗在TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五株實驗菌株上，進(jìn)行Ames試驗。本實驗分別設(shè)有自發(fā)回復(fù)突變組，溶劑對照組，陽性對照組和實驗組。溶劑對照組接近自發(fā)突變水平，而陽性對照組菌落數(shù)為自發(fā)突變水平的3倍以上。自發(fā)回復(fù)突變組和溶劑對照組回復(fù)突變菌落數(shù)均在本實驗室的歷史對照數(shù)據(jù)范圍內(nèi)。實驗過程無平皿污染，證明該實驗系統(tǒng)有效。在本實驗條件下，9-硝基米諾環(huán)素在菌株TA100間接（+S9）致突變實驗中，在劑量為320μg/皿、160μg/皿和80μg/皿時，觀察到回復(fù)突變數(shù)顯著增加，并為溶劑對照的2倍以上；在直接（-S9）致突變實驗中，在劑量為160μg/皿和80μg/皿時，觀察到回復(fù)突變數(shù)顯著增加，并為溶劑對照的2倍以上。在本實驗條件下，9-硝基米諾環(huán)素在菌株TA1535直接（-S9）致突變實驗中，在劑量為625μg/皿和320μg/皿時，回復(fù)突變菌落數(shù)為溶劑對照的2倍以上，但未達(dá)到3倍，在間接（+S9）致突變實驗中，在劑量為62