熒光蛋白-(整理)

熒光定義熒光（fluorescence）又作“螢光”，是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光（通常是紫外線或X射線）照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長長的出射光（通常波長在可見光波段）；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。原理光照射到某些原子時(shí)，光的能量使原子核周圍的一些電子由原來的軌道躍遷到了能量更高的軌道，即從基態(tài)躍遷到第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等。第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等是不穩(wěn)定的，所以會恢復(fù)基態(tài)，當(dāng)電子由第一激發(fā)單線態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，能量會以光的形式釋放，所以產(chǎn)生熒光。熒光是物質(zhì)吸收光照或者其他電磁輻射后發(fā)出的光。大多數(shù)情況下，發(fā)光波長比吸收波長較長，能量更低。但是，當(dāng)吸收強(qiáng)度較大時(shí)，可能發(fā)生雙光子吸收現(xiàn)象，導(dǎo)致輻射波長短于吸收波長的情況發(fā)射。當(dāng)輻射波長與吸收波長相等時(shí)，既是共振熒光。熒光強(qiáng)度：熒光強(qiáng)度與該種物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率、消光系數(shù)以及含量等因素有關(guān)。熒光量子產(chǎn)率Q：量子產(chǎn)率表示物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)化為熒光的本領(lǐng)，是熒光物質(zhì)發(fā)出光子數(shù)與吸收光子數(shù)的比值。熒光蛋白分子的亮度由其量子產(chǎn)率與消光系數(shù)的乘積決定，與成像檢測靈敏度密切相關(guān)。熒光蛋白綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）在光譜的綠光區(qū)（500nm-525nm）已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種熒光蛋白，而且來源廣泛，包括不同種屬的Aequorea、橈足類動物、文昌魚以及珊瑚。然而多數(shù)有齊聚反應(yīng)，即使最好的熒光蛋白與EGFP相比，也沒有明顯的優(yōu)點(diǎn)?；蛟S目前活細(xì)胞成像最好的選擇是GFP衍生的Emerald（祖母綠），它與EGFP的特性相似。Emerald包含F(xiàn)64L和S65T突變，另外還有四個(gè)點(diǎn)突變從而改進(jìn)了折疊、37℃時(shí)的突變率以及亮度。雖然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些環(huán)境下其定量成像會受到影響。下面主要介紹GFP及其衍生型熒光蛋白：（1）來源綠色熒光蛋白最早由美籍日裔科學(xué)家下村修于1962年在水母中發(fā)現(xiàn)。這種蛋白質(zhì)在藍(lán)色波長范圍的光照激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，其發(fā)光過程需要冷光蛋白質(zhì)Aequorin的幫助，而且，這個(gè)冷光蛋白質(zhì)可與鈣離子（Ca2+）相互作用。在水母中發(fā)現(xiàn)的野生型綠色熒光蛋白的分子量較小，僅為27~30kDa，而編碼GFP的基因序列也很短，為2.6kb。（2）性質(zhì)GFP由238個(gè)氨基酸殘基組成。GFP序列中的65-67位殘基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自發(fā)形成熒光發(fā)色基團(tuán)——對羥基苯咪唑啉酮GFP的激發(fā)光譜在400nm附近有一個(gè)主激發(fā)峰，在470nm附近有一個(gè)次激發(fā)峰。發(fā)射光譜在505nm附近有一尖銳的主發(fā)射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，無光漂白現(xiàn)象（Photobleaching），用甲醛固定和石蠟包埋亦不影響其熒光性質(zhì)。在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域中，綠色熒光蛋白基因常被用作報(bào)告基因。（3）野生型野生型GFP（wildtypeGFP,wtGFP）從一開始就引起了人們極大的興趣，而且被用作新型的簡單報(bào)告基因及體內(nèi)標(biāo)記，但GFP在異源生物體中的表達(dá)并非那么簡單。例如，研究人員很早就發(fā)現(xiàn)需要在較高的溫度下孵育才能在細(xì)胞或生物體中表達(dá)GFP，并且wtGFP在37℃的熱穩(wěn)定性差。這些都阻礙了它在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。這些難題促使人們進(jìn)一步篩選分離wtGFP的變體。現(xiàn)在，人們已經(jīng)找到了熒光強(qiáng)度更強(qiáng)且更耐熱的變體。這些變體多數(shù)為經(jīng)突變的脫輔基蛋白，它們可防止高溫導(dǎo)致的錯(cuò)誤折疊。近年來出現(xiàn)的新型wtGFP基因突變體的激發(fā)和發(fā)射譜發(fā)生了改變，熱穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度得到了提高，GFP報(bào)告基因在小鼠中的應(yīng)用就是以這些變體作為基礎(chǔ)的。（4）增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）現(xiàn)在，應(yīng)用最為廣泛的是紅移變體增強(qiáng)型GFP（EGFP）。諸如EGFP這些紅移變體的最大激發(fā)峰發(fā)生紅向移動，大約為490nm，這一波長也恰好是多數(shù)分光設(shè)備、流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡的常用波長。EGFP有兩個(gè)氨基酸突變，當(dāng)被藍(lán)光激發(fā)時(shí)，它發(fā)出的熒光要比wtGFP亮30-40倍。wtGFP和包括EGFP在內(nèi)的多數(shù)變體半衰期長，所以不適合精確追蹤表達(dá)的減少或損耗。（5）不穩(wěn)定增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（dEGFP）為克服這一問題，人們在1998年構(gòu)建了不穩(wěn)定增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（dEGFP）。原理就是將EGFP的cDNA融合到小鼠鳥氨酸脫羧酶（Ornithinedecarboxylase,ODC）基因的C-末端。ODC含有一個(gè)PEST序列，這個(gè)序列可促進(jìn)該蛋白在細(xì)胞內(nèi)四、熒光素和熒光素酶1、螢火蟲熒光素酶目前常用的螢火蟲熒光素酶來源于北美螢火蟲(Photinuspyralis)，是一個(gè)61kDa的單體酶，無需表達(dá)后修飾，直接具有完全酶活，反應(yīng)需要底物熒光素以及ATP、O2、Mg2+等的參與。海腎熒光素酶海腎熒光素酶來源于海腎（Renillareniformis），是一個(gè)36kDa的單體酶，表達(dá)后無需修飾，即可具有完全酶活。反應(yīng)只需要腔腸素（Coelenterazine）和O2參與。Gussia熒光素酶Gussia