細(xì)菌對(duì)藥物的敏感試驗(yàn)考點(diǎn)總結(jié)

細(xì)菌對(duì)藥物的敏感試驗(yàn)考點(diǎn)總結(jié)第一節(jié)臨床常用抗菌藥物簡(jiǎn)介青霉素與青霉素結(jié)合蛋白（PBP）結(jié)合，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成。種類(lèi)：青霉素G、青霉素V。（2）耐青霉素酶青霉素種類(lèi)：甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林。作用于產(chǎn)青霉素酶的葡萄球菌。1）氨基組青霉素：氨芐西林、阿莫西林。作用于青霉素敏感的細(xì)菌、大部分大腸埃希菌、奇異變形桿菌、流感嗜血桿菌等G-桿菌。2）羧基組青霉素：羧芐西林、替卡西林。作用于產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細(xì)菌和假單胞菌。3）脲基組青霉素：美洛西林、阿洛西林、哌拉西林。作用于產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細(xì)菌和假單胞菌。2.頭孢菌素類(lèi)頭孢菌素與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合，發(fā)揮抑菌和殺菌效果。G＋G－桿菌：三代＞二代＞一代第四代頭孢菌素作用幾乎相同，具有抗假單胞菌的作用。（1）第一代頭孢菌素：有頭孢噻啶、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢吡硫、頭孢羥（2）第二代頭孢菌素：有頭孢孟多、頭孢呋辛、頭孢尼西、頭孢雷特、頭孢克洛、頭孢丙烯、氯碳頭（3）第三代頭孢菌素：有頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑肟、頭孢哌酮、頭孢克肟、頭孢布烯、頭孢地尼、頭孢泊肟酯。（4）第四代頭孢菌素：有頭孢匹羅、頭孢噻利、頭孢吡肟和頭孢吡普。3.其他β-內(nèi)酰胺類(lèi)氨曲南和卡蘆莫南。定的抗菌活性。頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢美唑。對(duì)G＋菌有較好的抗菌活性，對(duì)厭氧菌有高度抗菌活性，但對(duì)非發(fā)酵菌無(wú)效。目前抗菌譜最廣的抗菌藥物，具有快速殺菌亞胺培南、美羅培南、比阿培南、帕尼培南、多利培南。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑：與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物聯(lián)用能增強(qiáng)后者的抗菌活性。2）舒巴坦：常與氨芐西林或頭孢哌酮聯(lián)合應(yīng)用于腸道感染；對(duì)不動(dòng)桿菌屬的作用強(qiáng)。3）他唑巴坦：抑酶作用范圍廣，幾乎包括所有β-內(nèi)酰胺酶。酶抑制作用優(yōu)于克拉維酸和舒巴坦。加酶抑制劑的復(fù)合制劑用于產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性和陽(yáng)性細(xì)菌。包括氨芐西林-舒巴坦、替卡西林-克拉維酸、阿莫西林-克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦及頭孢哌酮-舒4.氨基苷類(lèi)①依靠離子的吸附作用，吸附在菌體表面，造成膜的損傷。①鏈霉菌屬：如鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龍霉素、新霉素；③半合成氨基苷類(lèi)：阿米卡星、奈替米星、地貝卡星等，氨基苷類(lèi)抗菌藥物對(duì)需氧G－桿菌有較強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)G＋球菌有一定的活性。5.喹諾酮類(lèi)①通過(guò)外膜孔蛋白和磷脂滲透進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。（1）第一代：為窄譜抗菌藥物，對(duì)G＋球菌無(wú)作用；比較這類(lèi)藥的抗菌活性強(qiáng)度依次為環(huán)丙沙星、氧氟沙星、羅美沙星、氟羅沙星、培氟沙星、諾氟沙星。沙星、加替沙星、格帕沙星、莫西沙星等。6.大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)①可逆結(jié)合細(xì)菌核糖體50S大亞基的23S單位，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成和肽鏈延伸；②肺部濃度較血清濃度高；③新一代大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能，能增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能。國(guó)內(nèi)常用的有紅霉素、吉他霉素、麥迪霉素、乙酰螺旋霉素。新一代大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)有克拉霉素、羅紅霉素、地紅霉素、氟紅霉素、阿奇霉素和乙酰麥迪霉素。第二節(jié)細(xì)菌對(duì)藥物的敏感試驗(yàn)概念：指在體外測(cè)定藥物殺死細(xì)菌能力的試驗(yàn)。①幫助臨床醫(yī)師選擇效果最佳的藥物進(jìn)行感染性疾病的治療，以避免由于抗菌藥物使用不當(dāng)造成的許多不良后果；②進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查；③藥敏試驗(yàn)結(jié)果還可以用來(lái)做某些細(xì)菌的鑒定；④指導(dǎo)有關(guān)部門(mén)制定流行耐藥菌的防治措施。一、擴(kuò)散法（K-B法）美國(guó)NCCLS紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)分委會(huì)所推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法是以Bauer-Kirby建立的K-B法，是目前公抑菌圈的大小可以反映待檢菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，與該藥對(duì)待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)相2.抗菌藥物紙片：選擇直徑6.35mm，吸水量20μl的專(zhuān)用藥敏紙片。8h。用生理鹽水或肉湯校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（1.5×108/ml的含菌量），校正后的菌液應(yīng)在置室溫干燥3～5min后用無(wú)菌鑷子或貼紙片機(jī)將含藥紙片貼于含菌瓊脂表面。各紙片中心距離不小于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。平板經(jīng)室溫放置15min再倒放于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18小時(shí)后閱讀結(jié)果。（四）結(jié)果判讀抑菌圈的邊緣以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。每批試驗(yàn)都應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照，只有對(duì)照菌株的敏感度符合標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才是可靠的。試驗(yàn)結(jié)果解釋分為三級(jí)：敏感（S表示常規(guī)劑量的測(cè)定藥物在體內(nèi)所達(dá)到的濃度能抑制或殺滅待測(cè)菌。耐藥（R表示常規(guī)劑量的測(cè)定藥物在體內(nèi)達(dá)到有效濃度時(shí)不能抑制檢測(cè)菌生長(zhǎng)。（五）影響結(jié)果的因素2.抗菌藥物紙片紙片含藥量是影響抑菌圈大小的主要因素，保存條件以低溫干燥為佳。3.菌量加大菌量可使抑菌圈減小，相反可使抑菌圈擴(kuò)大。4.操作質(zhì)量（2）接種細(xì)菌后應(yīng)在室溫放置片刻。（4）測(cè)量抑菌量應(yīng)仔細(xì)、精確，從生長(zhǎng)刺激帶測(cè)量。1.質(zhì)控菌株采用標(biāo)準(zhǔn)菌株是進(jìn)行質(zhì)控的主要措施。金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853，糞腸球菌ATCC29212或ATCC33186。質(zhì)控得到的抑菌圈直徑在連續(xù)20個(gè)數(shù)值中，僅允許有一個(gè)超出這個(gè)范圍。二、稀釋法體外定量測(cè)定抗菌藥物抑制待測(cè)菌生長(zhǎng)活性的方法。根據(jù)稀釋培養(yǎng)基的不同，分為肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法。瓊脂稀釋法是細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。稀釋法所測(cè)得的某抗菌藥物抑制待測(cè)菌生長(zhǎng)的最低濃度為最低（或最小）抑菌濃度（MIC稀釋法也可測(cè)定最小殺菌濃度（MBC）。（一）肉湯稀釋法以水解酪蛋白（M-H）液體培養(yǎng)基將抗菌藥作不同濃度的稀釋?zhuān)缓蠼臃N待測(cè)菌，定量測(cè)定抗菌藥物抑制該菌的最低濃度（MIC）或殺死該菌的最低（或最小）殺菌濃度（MBC）。（1）抗菌藥物原液的配制：溶劑一般為蒸餾水、磷酸鹽緩沖液或乙醇等，稀釋劑多為蒸餾水。原液以過(guò)濾法除菌，小量分裝使用。大部分抗菌藥物原液在-20℃以下可保存三個(gè)月，而在4℃以下只能保存一周。（2）培養(yǎng)基：一般細(xì)菌采用M-H液體培養(yǎng)基。在已分純的待測(cè)菌平板上挑取4～5個(gè)形態(tài)相同的菌落接種于3～5mlM-H液體培養(yǎng)基內(nèi)，35℃培養(yǎng)4~3.試驗(yàn)步驟菌生長(zhǎng)對(duì)照和質(zhì)控菌生長(zhǎng)對(duì)照管各一支，每管1ml。（3）將已校正濃度的待測(cè)菌懸液依次加入含藥管內(nèi)，每管0.05ml，混勻。各試管置35℃培養(yǎng)后觀(guān)察凡無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度即為該待測(cè)菌最低抑菌濃度（MIC）。再以0.01ml容量接種環(huán)取肉眼觀(guān)察認(rèn)為無(wú)菌生長(zhǎng)的試管移種一環(huán)于血瓊脂平板作次養(yǎng)過(guò)夜后觀(guān)察最低藥物濃度能殺死99.9%原始種入的細(xì)菌即為該菌的最低殺菌濃度（MBC）。（1）培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的pH、滲透壓及電解質(zhì)。（2）抗菌藥物：抗菌藥物必須采用標(biāo)準(zhǔn)粉劑。配好的藥物原液應(yīng)在有效期內(nèi)使用。（3）結(jié)果觀(guān)察時(shí)間金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、糞腸球菌ATCC29212、銅綠假單胞菌ATCC27853。超過(guò)或低于預(yù)期值范圍一個(gè)稀釋度以上，不應(yīng)向臨床發(fā)出報(bào)告，應(yīng)檢查出現(xiàn)差錯(cuò)的原因以及標(biāo)準(zhǔn)菌株被污染和變異的可能性。（二）瓊脂稀釋法將待測(cè)菌接種于含不同濃度藥物的瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)后觀(guān)察菌落的生長(zhǎng)情況，以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度。稀釋法與擴(kuò)散法相結(jié)合的一種方法，直接定量試驗(yàn)。把含有干燥的穩(wěn)定的藥物塑料條貼在瓊脂平板的表面，經(jīng)培養(yǎng)在一定范圍抑制細(xì)菌生成，形成抑菌環(huán)。1.最低殺菌濃度最低殺菌濃度是某抗菌藥物能殺滅99.9%以上的測(cè)試菌量的最低藥物濃度。測(cè)定方法就是稀釋法MIC測(cè)定的基礎(chǔ)上通過(guò)再轉(zhuǎn)種、再孵育，最終測(cè)得某種抗菌藥物對(duì)被測(cè)菌的MBC。2.時(shí)間-殺菌曲線(xiàn)主要用于評(píng)價(jià)一種抗菌藥物對(duì)測(cè)試菌的殺菌速率，以及兩種或兩種以上抗菌藥物對(duì)測(cè)試菌的聯(lián)合殺菌最后將各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的平均菌落計(jì)數(shù)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制殺菌曲線(xiàn)。四、體外聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)（一）聯(lián)合抑菌試驗(yàn)1.試管棋盤(pán)（方陣）稀釋法根據(jù)測(cè)定結(jié)果按下列公式計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)（FICFIC=A藥聯(lián)合時(shí)的MIC/A藥單測(cè)的MIC＋B藥聯(lián)合時(shí)的MIC/B藥單測(cè)的MIC2.微量棋盤(pán)（方陣）稀釋法3.瓊脂棋盤(pán)（方陣）稀釋法基本方法與MIC測(cè)定的瓊脂稀釋法相同，以含有不同組合濃度的MH瓊脂平板代替以上含有不同組合濃度藥物的M-H肉湯試管。按“棋盤(pán)”稀釋法原則組合。（二）聯(lián)合殺菌試驗(yàn)聯(lián)合殺菌試驗(yàn)所用的方法同前述的時(shí)間-殺菌曲線(xiàn)法。分別測(cè)定并繪出兩種藥物對(duì)被測(cè)菌的單獨(dú)殺菌曲線(xiàn)和聯(lián)合后的殺菌曲線(xiàn)，根據(jù)殺菌曲線(xiàn)判斷聯(lián)合用藥五、厭氧菌、結(jié)核分枝桿菌及酵母樣真菌的體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)（一）厭氧菌的體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)除培養(yǎng)基、操作環(huán)境和培養(yǎng)條件等根據(jù)厭氧菌的特定需要變動(dòng)外，基本原理和方法與需氧菌稀釋法藥（二）結(jié)核分枝桿菌的體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)主要有比例法、絕對(duì)濃度法和耐藥率法。直接法是直接采用涂片陽(yáng)性的標(biāo)本直接藥敏試驗(yàn)，優(yōu)點(diǎn)是可提前2～3周獲得結(jié)果，缺點(diǎn)是易污染雜菌用制備好菌懸液同時(shí)接種含有抗菌藥物的培養(yǎng)基和不含抗菌藥物的生長(zhǎng)對(duì)照培養(yǎng)基，如果含有抗菌藥物培養(yǎng)基上的細(xì)菌生長(zhǎng)量超出生長(zhǎng)對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)量的1%時(shí)即判斷為耐藥。（三）酵母樣真菌的體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)常量肉湯稀釋法（1）藥物稀釋?zhuān)簩⒋郎y(cè)的抗菌藥物用1640培養(yǎng)基進(jìn)行一系列稀釋?zhuān)謩e加入試管內(nèi)，每管0.1ml。（2）接種菌懸液準(zhǔn)備：挑取5個(gè)直徑≥1mm的菌落混懸于5ml生理鹽水中，校正至0.5麥?zhǔn)蠞岫?。接種前用生理鹽水再稀釋1：100，最后用1640培養(yǎng)基再稀釋10倍。最終接種菌量為1×103（4）結(jié)果判斷：肉眼觀(guān)察各管的生長(zhǎng)情況。二性霉素B的MIC為抑制測(cè)試菌肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度。5-氟胞嘧啶和吡咯類(lèi)常采用80%MIC判斷標(biāo)準(zhǔn)，即抑制80%檢測(cè)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為其MIC。（5）質(zhì)量控制：標(biāo)準(zhǔn)菌株在與測(cè)試菌相同條件下進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。六、體內(nèi)抗菌藥物的濃度與活性測(cè)定（一）體內(nèi)抗菌藥物的濃度測(cè)定1.微生物測(cè)定法——瓊脂擴(kuò)散法2.非微生物測(cè)定法（二）體內(nèi)抗菌藥物的活性測(cè)定臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定體液內(nèi)抗菌藥物活性的方法，有血清抑菌力和殺菌力測(cè)定，其原理與肉湯稀第三節(jié)細(xì)菌的耐藥性和產(chǎn)生機(jī)制常見(jiàn)抗生素及作用機(jī)制：抗生素抗生素青霉素類(lèi)、頭孢菌素、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、碳青酶烯類(lèi)、糖肽類(lèi)結(jié)合細(xì)菌核糖體50S大亞基，抑制蛋白合成大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、克林霉素、氯霉素類(lèi)硝基呋喃類(lèi)磺胺類(lèi)作用于DNA螺旋酶，抑制DNA合成干擾細(xì)菌氧化還原系統(tǒng)，阻斷代謝競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合二氫葉酸合成酶作用機(jī)制阻斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成一、細(xì)菌耐藥的機(jī)制1.產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥的主要機(jī)制。2.產(chǎn)生鈍化酶如氨基糖苷類(lèi)鈍化酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶等。3.青霉素結(jié)合蛋白的改變?nèi)鏜RSA的耐藥機(jī)制。4.藥敏作用靶位的改變5.抗菌藥物滲透障礙二、細(xì)菌耐藥性表型的檢測(cè)1.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）（1）超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）常見(jiàn)于肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、大腸埃希菌和奇異變形桿菌。（2）K-B法篩查可選用頭孢泊肟≤17mm、頭孢他啶≤22mm、頭孢噻肟≤27mm、氨曲南≤27mm、頭孢曲松≤25mm。一組加棒酸的抑菌環(huán)直徑與相應(yīng)不加棒酸的抑菌環(huán)直徑相差≥5mm，則判斷此菌為產(chǎn)ESBL菌株。稀釋法若兩組中任何一組加棒酸的MIC值比相應(yīng)不加棒酸的MIC值降低3個(gè)以上稀釋倍數(shù)，則判斷此（3）產(chǎn)ESBL的克雷伯菌屬及大腸埃希菌分離株，臨床上可能對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)及氨曲南治療無(wú)效，即便體外有時(shí)敏感。對(duì)所有產(chǎn)ESBL的菌株應(yīng)當(dāng)報(bào)告為耐所有青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)及氨曲南。2.葡萄球菌屬（1）MRS對(duì)耐甲氧西林的耐藥是由于本身存在的MecA基因編碼的異常PBPs所致。MRS除對(duì)甲氧西林（2）用頭孢西丁紙片法或稀釋法檢測(cè)MRS。頭孢西丁MIC≥8μg/ml應(yīng)報(bào)告苯唑西林耐藥。（3）MRS對(duì)頭孢菌素和復(fù)合性β-內(nèi)酰胺類(lèi)，如阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、替卡西林/克3.腸球菌屬（1）對(duì)氨基糖苷類(lèi)呈耐藥性的腸球菌（HLAR）的測(cè)定用高濃度慶大霉素或鏈霉素進(jìn)行高水平耐藥篩選，可預(yù)測(cè)氨芐西林、青霉素或萬(wàn)古霉素和一種氨基糖苷類(lèi)的協(xié)同效應(yīng)。（2）紙片擴(kuò)散法慶大霉素（120μg）、鏈霉素（300μg）判斷生長(zhǎng)出菌落為HLAR。（3）對(duì)于腸球菌屬，頭孢菌素、氨基糖苷類(lèi)（篩選高水平耐藥除外）、克林霉素和磺胺類(lèi)可在體外顯判斷：菌落生長(zhǎng)為耐藥。4.肺炎鏈球菌（1）肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥是由于PBP的改變，減低了對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)的親和力。（2）肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥性檢查（PRP）采用1μg苯唑西林的紙片篩選法。苯唑西林的抑菌圈≤19mm的菌株應(yīng)當(dāng)測(cè)定青霉素和頭孢噻肟或頭孢曲松的MICs。5.產(chǎn)AmpC酶的革蘭陰性桿菌（1）AmpC酶屬于BushⅠ型酶，主要由腸桿菌屬、弗勞地枸櫞酸鹽桿菌、摩根菌、黏質(zhì)沙雷菌、銅綠假單胞菌產(chǎn)生，由染色體介導(dǎo)，又稱(chēng)染色體Ⅰ型酶。（2）對(duì)青霉素