微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告公開(kāi)課一等獎(jiǎng)?wù)n件省課獲獎(jiǎng)?wù)n件

微生物試驗(yàn)報(bào)告產(chǎn)青霉素酶桿菌分離、優(yōu)化、誘導(dǎo)及酶活測(cè)定第1頁(yè)一二三四點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本目錄試驗(yàn)成果試驗(yàn)操作分析討論介紹第2頁(yè)一、介紹枯草芽孢桿菌廣泛分布于土壤及腐敗有機(jī)物中，易在枯草津汁中繁殖而得名。本試驗(yàn)中通過(guò)從土樣中取得枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬一種。單個(gè)細(xì)胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生青霉素酶，并且青霉素和磷酸鹽對(duì)其有誘導(dǎo)作用，本試驗(yàn)中通過(guò)青霉素對(duì)其誘導(dǎo)，從而進(jìn)行菌種優(yōu)化。第3頁(yè)一、介紹青霉素酶是β-內(nèi)酰胺酶1種,其作用機(jī)理是水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素β-內(nèi)酰胺環(huán)，使抗生素失去其活性，是致病菌產(chǎn)生耐藥性主要原因之一，因此對(duì)青霉素酶研究在青霉素用于臨床很快便全面展開(kāi)了。人們?cè)谘芯壳嗝顾孛高^(guò)程中，除了發(fā)覺(jué)它有害一面外，也發(fā)覺(jué)了某些有利方面。如:在β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素藥品質(zhì)量檢查中，利用青霉素酶進(jìn)行無(wú)菌檢查是一種非常有效、簡(jiǎn)便、快捷辦法，可定量檢查出青霉素類(lèi)藥品中污染微生物程度。因此研究青霉素酶有了另一番意義。青霉素作誘導(dǎo)劑使用，細(xì)胞上特殊接收體與青霉素結(jié)合成份(penicillin2bindingcomponent,PBC)相同，可用青霉素結(jié)合成份與誘導(dǎo)劑“親和力”不一樣來(lái)解釋青霉素酶產(chǎn)率高低。PBC與誘導(dǎo)劑相結(jié)合是青霉素酶合成過(guò)程中很主要影響原因之一。第4頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程如圖為大體操作過(guò)程第5頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程

試驗(yàn)日程4月8日青霉素濃度梯度平板制備，斜面培養(yǎng)基配制，滅菌。4月9日采集土壤樣品及土壤樣品處理，將所得試驗(yàn)所用菌液用平面

涂布法接種到做好培養(yǎng)皿上，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。4月15日鏡檢。挑取桿菌接種到10單位梯度培養(yǎng)基上。4月22-5月5日優(yōu)化菌種。增加青霉素素濃度度從10、20、50、100、500、

1000、2023、5000、10000、20230單位進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化，

增加枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶能力，并將10000萬(wàn)單位菌種進(jìn)行斜面保存。5月6日-13日搖瓶發(fā)酵。對(duì)上面得到10000單位菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并

對(duì)發(fā)酵液稀釋后進(jìn)行酶活測(cè)定。5月13日-17日菌株誘變5月20日將一萬(wàn)單位保存菌種放入1000、2023、4000、8000、

10000單位青霉素液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并觀測(cè)菌種生長(zhǎng)情況第6頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程①器材：37℃恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、分析天平、堿式滴定管、高壓滅菌鍋、接種環(huán)、三角瓶、移液槍、注射器、培養(yǎng)皿、三角棒、酒精燈、移液管、洗耳球、恒溫水浴鍋、電磁爐、電磁鍋、烘箱等。②材料：土壤（30教旁草地土）160萬(wàn)單位/0.96g青霉素、硫代硫酸鈉固體、碘固體、可用性淀粉。第7頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程細(xì)菌培養(yǎng)基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉4g

蒸餾水1000mL（若為固體培養(yǎng)基，加20g瓊脂），pH7.4

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉4g

瓊脂20g

蒸餾水1000mL,pH7.4第8頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨15g甘油50g

氯化鈉4g0.1％硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)溶液0.5ml

枸櫞酸鈉5.88g20％硫酸鎂(MgSO4·7H2O)溶液1ml

磷酸氫二鉀4g肉浸液1000ml

對(duì)于上面3種培養(yǎng)基，為了合適枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，進(jìn)行pH調(diào)整。滅菌后pH7.0～7.2（由于滅菌后不好調(diào)pH，因而滅菌前調(diào)pH7.2～7.4，查資料知滅菌后pH降0.2左右）第9頁(yè)點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本

二、試驗(yàn)過(guò)程從土壤中分離菌種并接種培養(yǎng)

涂布培養(yǎng)青霉素濃度梯度平板制備青霉素溶液制備處理土樣，取得菌液第10頁(yè)點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本

二、試驗(yàn)過(guò)程菌種篩選鏡檢水洗干燥染色固定涂片菌種篩選第11頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程細(xì)菌培養(yǎng)基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉4g

蒸餾水1000mL（若為固體培養(yǎng)基，加20g瓊脂），pH7.4

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉4g

瓊脂20g

蒸餾水1000mL,pH7.4第12頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程菌種優(yōu)化

10單位保存菌種（1萬(wàn)單位）500、1000

單位（固液）20、50、100單位1萬(wàn)、2萬(wàn)單位斜面培養(yǎng)基配制：配制150ml斜面培養(yǎng)基（配方見(jiàn)試驗(yàn)材料）、倒入試管中（約占試管1/3體積），121℃高壓滅菌30min。待培養(yǎng)基冷卻到45℃左右后，擺成斜面后備用。第13頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程搖瓶發(fā)酵1、配制100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基3個(gè)，121℃滅菌30min，配方如上面試驗(yàn)材料，然后加入加入上述配得10萬(wàn)單位青霉素溶液10ml，得到1萬(wàn)單位青霉素液體發(fā)酵培養(yǎng)基。2、將保種1萬(wàn)單位青霉素接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，放入恒溫?fù)u床培養(yǎng)24h。3、觀測(cè)個(gè)培養(yǎng)基渾濁成度。9、對(duì)發(fā)酵液處理，進(jìn)行下面酶活力測(cè)定。第14頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程青霉素酶活力測(cè)定準(zhǔn)備工作：1、青霉素酶溶液制備2、磷酸鹽緩沖液(pH7.0)制備3、醋酸鈉緩沖液(pH4.5)4、碘滴定液制備5、硫代硫酸鈉滴定液配制6、青霉素溶液配制第15頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程測(cè)定：試驗(yàn)組：精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，預(yù)熱至37℃后，精密加入已預(yù)熱青霉素酶稀釋液25ml，迅速混勻，在37℃精確放置1小時(shí)，精密量取3ml，立即加至已精密量取碘滴定液(0.01mol/L)［精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸鈉緩沖液(pH4.5)稀釋至刻度］25ml中,在室溫暗處放置15分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L)滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉批示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失。空白組：取已預(yù)熱青霉素溶液2ml，在37℃放置1小時(shí)，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀釋液1ml，在室溫暗處放置15分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L)滴定。第16頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程計(jì)算辦法：E＝(B－A)×M×F×D×100

E為青霉素酶活力，單位／(ml.小時(shí))；B為空白滴定所消耗上述硫代硫酸鈉滴定液容量，ml；A為樣品滴定所消耗上述硫代硫酸鈉滴定液容量，ml；M為硫代硫酸鈉滴定液濃度，mol/L；F為在相同條件下，每1ml上述碘滴定液(0.01mol/L)相稱(chēng)于青霉素效價(jià)單位；D為青霉素酶溶液稀釋倍數(shù)。

第17頁(yè)紫外誘變繁殖體取得點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本二、試驗(yàn)過(guò)程倒、涂平板菌株誘變25℃培養(yǎng)第18頁(yè)二、試驗(yàn)過(guò)程再搖瓶培養(yǎng)由于誘變未得到想要菌種，為證明取得了耐1萬(wàn)單位/ml菌種，對(duì)保存1萬(wàn)單位菌種進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)觀測(cè)成果。1.配制5管5ml液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻。2.分別加入0.5ml、0.4ml、0.2ml、0.1ml、0.05ml,10萬(wàn)單位青霉素溶液，得到10000、8000、4000、2023、1000單位青霉素培養(yǎng)液。3.挑去保存10000單位菌種接種后，37℃，搖瓶培養(yǎng)24h觀測(cè)菌種生長(zhǎng)情況。第19頁(yè)三、試驗(yàn)成果篩選成果第20頁(yè)三、試驗(yàn)成果菌種優(yōu)化成果第21頁(yè)三、試驗(yàn)成果酶活力測(cè)定成果三個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)菌液進(jìn)行測(cè)酶活，對(duì)比后酶活最大一種。發(fā)酵培養(yǎng)基酶活力：①成果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：稀釋1000倍D=1000B-A=0.2ml硫代硫酸鈉滴定B液濃度0.01mol/L（經(jīng)硫代硫酸鈉直接滴定碘精確測(cè)出濃度）碘滴定液濃度0.01mol/L②計(jì)算：E=(B－A)×M×F×D×100=0.2×0.01×742×1000×100=148400單位／(ml.小時(shí))