天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座

（3）經(jīng)典薄層層析（TLC）上世紀(jì)三十年代末開(kāi)始應(yīng)用，1956年，德國(guó)人使薄層板制備儀器化，并使之商品化。從此，TLC廣泛用于有機(jī)化學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。并開(kāi)展了旋轉(zhuǎn)TLC、高效TLC、巨型板TLC、離心液相色譜、反相TLC……。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第1頁(yè)液—固吸附層析：氧化鋁、硅膠、聚酰胺液—液分配層析：纖維粉、硅藻土、硅膠天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第2頁(yè)①原理

薄層層析原理同對(duì)應(yīng)柱層析原理。②吸附劑選擇

硅膠G（石膏）、硅膠H、硅膠HF254、硅膠GF254、硅膠60HR（不含黏合劑純品，用于定量或光譜測(cè)定）。氧化鋁G（石膏）、堿性氧化鋁H、堿性氧化鋁HF254天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第3頁(yè)③薄層板制備A.硅膠

硬板：硅膠G或GF254+0.3~0.6%CMC-Na（1：3）。厚度0.2~0.3mm，110~105℃活化0.5~1h。制備TLC1~3mm。防止氣泡：a、順一個(gè)方向研磨b、加少許EtOH天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第4頁(yè)B.Al2O3軟板：玻棒推行，厚度0.5~1mm，硬板：氧化鋁G+水（1：2）

200℃活化3~4h—活度II；150℃活化4h—活度III~IV。C.聚酰胺板

鋪板聚酰胺薄膜

天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第5頁(yè)④展開(kāi)劑選擇洗脫（展開(kāi)）規(guī)律：展開(kāi)劑極性越大，推進(jìn)能力越強(qiáng)展開(kāi)劑極性越小，推進(jìn)能力越弱化合物極性越大，難推進(jìn)化合物極性越小，易推進(jìn)反相——與正相相反酸性成份——酸性展開(kāi)劑堿性成份——堿性展開(kāi)劑Rf：0.2~0.8較適當(dāng)正相天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第6頁(yè)⑤操作方法：制板、點(diǎn)樣、展開(kāi)和定位。⑥展開(kāi)方式：上行展開(kāi)（直立上行和傾斜上行）、徑向展開(kāi)、屢次展開(kāi)和雙向展開(kāi)。⑦特殊薄層：熒光薄層、絡(luò)合薄層、酸堿薄層。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第7頁(yè)⑧薄層和紙層用途a.有效成份判定：用3種不一樣展開(kāi)劑展開(kāi)后，與對(duì)照品Rf值、顏色一致，即可初步識(shí)別；b.藥材真?zhèn)闻卸ǎ河?種不一樣展開(kāi)劑展開(kāi)后，與對(duì)照藥材斑點(diǎn)Rf值、顏色一致；c.柱層析分離條件探索：吸附——柱層吸附；分配——柱層分配d.小量制備分離：熒光或顯色確定位置，硬板譜帶刮下、軟板吸入法。e.定量分析（含量測(cè)定）：TLC掃描或洗脫比色。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第8頁(yè)（4）高效薄層色譜法（HPTLC）特點(diǎn)a、普通采取預(yù)制板，涂層均勻一致，重現(xiàn)性好。b、顆粒細(xì)小，粒度范圍窄，5~7um；斑點(diǎn)集中，分離好。c、展距短d、分離能力較TLC提升3倍，檢出靈敏度提升1~2個(gè)數(shù)量級(jí)。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第9頁(yè)硅膠薄層舉例：是判斷二斑點(diǎn)歸屬？

展開(kāi)劑：CHCL3-MeOH-HCOOH(15:5:1)顯色劑：ALCL3溶液。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第10頁(yè)ALCL3溶液顯色后，日光下觀察。ALCL3溶液顯色后，紫外下觀察。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第11頁(yè)(二)、分離純化法（5）聚酰胺層析

聚酰胺是經(jīng)過(guò)酰胺基聚合而成一類高分子化合物，分子中含有豐富酰胺基，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵結(jié)合而被吸附，依據(jù)吸附力大小不一樣，使能形成氫鍵與不能形成氫鍵化合物到達(dá)分離。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第12頁(yè)(二)、分離純化法

化合物吸附力大小與形成氫鍵數(shù)目標(biāo)多少相關(guān)；在水中形成氫鍵能力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中較弱，在堿性溶液中最弱。

聚酰胺吸附色譜原理

天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第13頁(yè)(二)、分離純化法

聚酰胺吸附層析―洗脫劑洗脫力由小到大為:水<甲醇<乙醇<丙酮<稀NH4OH<稀NaOH液<甲酰胺<尿素水液聚酰胺層析洗脫天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第14頁(yè)成份吸附難易:a形成氫鍵基團(tuán)多、吸附力強(qiáng)eg：COOH-CH2-CH2-COOH>CH3CH2CH2COOH

b對(duì)、間位酚OH>鄰位酚OH天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第15頁(yè)c芳香核、共軛雙鍵多、吸附力強(qiáng)d形成份子內(nèi)氫鍵、吸附力弱天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第16頁(yè)吸附原理:

雙重層析性能：氫鍵+極性吸附現(xiàn)有酰胺基，又有非極性脂肪鏈

如:黃酮苷(A)、對(duì)應(yīng)黃酮苷元(B)

含水溶劑洗脫（含水醇）：A>B（水中氫鍵牢靠，且對(duì)苷溶解性大）

非水溶劑洗脫（如CHCl3-MeOH）：B>A（極性吸附原理）

天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第17頁(yè)（6）凝膠層析A.分離原理

葡聚糖凝膠是由葡聚糖和甘油基經(jīng)過(guò)醚橋相交鏈而成多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

凝膠吸水后形成凝膠粒子，凝膠粒子組成網(wǎng)眼，小分子進(jìn)入，大分子流下。如同按照分子大小過(guò)篩一樣，故稱為“篩層析”。

天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第18頁(yè)(二)、分離純化法（6）凝膠層析依據(jù)物質(zhì)分子大小進(jìn)行分離。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第19頁(yè)（6）凝膠層析

此法慣用凝膠有葡聚糖凝膠（SephadexG-25）和羥丙基葡聚糖凝膠(SephadexLH-20)。前者只適合用于在水中應(yīng)用，而后者不但可在水中用，也可在有機(jī)溶劑中用或在水與有機(jī)溶劑混合溶劑中使用。

G型凝膠：水或含水醇上樣、洗脫——分離水溶性大分子化合物。SephadexLH-20凝膠（引入羥丙基）：可用有機(jī)溶劑——極性大、極性小化合物均可分離。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第20頁(yè)某中藥乙醇提取物硅膠薄層板在可見(jiàn)光下和紫外燈下斑點(diǎn)舉例：看某中藥提取物硅膠薄層結(jié)果與凝膠柱層析對(duì)比天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第21頁(yè)凝膠柱層析動(dòng)態(tài)過(guò)程天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第22頁(yè)（4）凝膠層析凝膠選?。翰灰粯臃肿恿糠秶衔镞x取不一樣規(guī)格凝膠。

凝膠商品物是干燥顆粒狀物質(zhì)，在使用前必需充分溶漲，使其網(wǎng)孔漲開(kāi)。網(wǎng)孔大小與其加入交鏈劑量相關(guān)。交聯(lián)度高，孔隙小，吸水時(shí)膨漲也小，反之，膨脹系數(shù)大。

天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第23頁(yè)(二)、分離純化法（7）離子交換層析

離子交換劑是高分子化合物，含有解離性離子交換基團(tuán)，在水溶液中能與其它陽(yáng)離子或陰離子其交換作用，而這種交換作用是可逆。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第24頁(yè)(二)、分離純化法（7）離子交換層析

離子交換樹(shù)脂是由有機(jī)高分子化合物組成網(wǎng)狀多孔性結(jié)構(gòu)材料，由二部分組成。母體結(jié)構(gòu)——組成多孔性網(wǎng)狀骨架交換基團(tuán)——多孔骨架內(nèi)部連接著相當(dāng)數(shù)量交換基團(tuán)

天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第25頁(yè)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：

R-SO3-H++M+OH-

R-SO3-M++H2O

陰離子交換樹(shù)脂：

R3-N+OH-+M-OH+

R3N+M-+H2O被分離成份因?yàn)樗嵝曰驂A性化合物解離系數(shù)不一樣，結(jié)合能力也就有所區(qū)分。當(dāng)用一定酸性或堿性溶液洗脫時(shí)，這些化合物依據(jù)解離系數(shù)差異而被分離。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第26頁(yè)(二)、分離純化法（7）離子交換層析如：陽(yáng)離子交換樹(shù)脂作用原理R-H+

+AlKH+R-AlKH+

+H+R-AlKH+

+NH4OHR-NH4+

+AlK+H2OR代表樹(shù)脂，AlK代表生物堿。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第27頁(yè)燒杯陽(yáng)離子樹(shù)脂柱滲漉筒分液漏斗天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第28頁(yè)(二)、分離純化法（8）大孔吸附樹(shù)脂層析法

大孔吸附樹(shù)脂是20世紀(jì)60年代末在離子交換劑和其它吸附劑應(yīng)用基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)一個(gè)新型樹(shù)脂。大孔樹(shù)脂多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，巨大比表面積使其含有良好吸附性能。它是白色顆粒狀物質(zhì)。

天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第29頁(yè)(二)、分離純化法大孔樹(shù)脂類型按其極性大小不一樣可分為四種：a．非極性吸附樹(shù)脂如DiaionHP-20b．中等極性吸附樹(shù)脂如AmberliteXAD-6

c．極性吸附樹(shù)脂如南大化工廠X-5、S-8d．強(qiáng)極性吸附樹(shù)脂如AmberliteXAD-11

天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第30頁(yè)(二)、分離純化法大孔樹(shù)脂性質(zhì)

1．穩(wěn)定性：大孔吸附樹(shù)脂理化性質(zhì)穩(wěn)定，但在水和有機(jī)溶劑中可吸收溶劑而膨脹，在室溫下對(duì)稀酸、稀堿穩(wěn)定；2．吸附原理：大孔吸附樹(shù)脂經(jīng)過(guò)物理吸附（范德華引力或氫鍵）和分子篩作用（多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）而實(shí)現(xiàn)分離；天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第31頁(yè)(二)、分離純化法

極性較大化合物普通適合用于中極性樹(shù)脂上分離。極性較小化合物普通適合用于非極性樹(shù)脂上分離。

3．比表面積越大，吸附容量也越大；4．吸附質(zhì)分子大小與樹(shù)脂孔徑相關(guān)。大孔樹(shù)脂性質(zhì)天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第32頁(yè)(二)、分離純化法洗脫液選擇

洗脫劑選擇基本要求依據(jù)“相同相溶”原理?？蛇x取水、不一樣濃度MeOH、EtOH、Me2CO。非極性大孔樹(shù)脂——洗脫劑極性越小，洗脫能力越強(qiáng)。

中極性大孔樹(shù)脂——用極性較大有機(jī)溶劑洗脫。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第33頁(yè)(二)、分離純化法大孔樹(shù)脂預(yù)處理與再生

預(yù)處理目標(biāo)是將樹(shù)脂內(nèi)孔殘余未聚合單體與致孔劑、分散劑、防腐劑等有機(jī)殘留物除去，提升樹(shù)脂潔凈度，提升樹(shù)脂使用安全性。

天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第34頁(yè)大孔吸附樹(shù)脂柱洗脫洗脫柱得3瓶洗脫液20％30％95％硅膠柱天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第35頁(yè)(二)、分離純化法大孔樹(shù)脂預(yù)處理與再生預(yù)處理：MeOH或Me2CO浸泡過(guò)夜，裝柱后連續(xù)洗滌至流出液加等量水無(wú)渾濁。再生：乙醇浸泡24小時(shí)，用2BV乙醇洗滌，至醇液中加水不呈白色混濁止。用2BV2%NaOH浸泡、洗滌，水洗至中性，再用5%HCl浸泡、洗滌，然后水洗至中性。另外，其存放時(shí)，應(yīng)保持顆粒濕潤(rùn)，不然一旦顆粒干了則顆粒易碎，此時(shí)則大孔樹(shù)脂不能使用了。天然藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第36頁(yè)(二