雜交水稻雜交品種ssr指紋圖譜的構建

雜交水稻雜交品種ssr指紋圖譜的構建

品種之間的形狀和特征特征的差異主要是由于基因差異。利用DNA分子標記鑒別不同品種基因型的差異是目前區(qū)別品種較為有效、快捷的方法。其中SSR標記具有操作簡便快捷、多態(tài)性高和穩(wěn)定性好等特點當前水稻的分子身份證及指紋數(shù)據(jù)庫構建工作主要集中在雜交種上,而親本的選擇和利用是選育優(yōu)勢雜交組合的關鍵,因此建立雜交水稻親本分子身份證及SSR指紋數(shù)據(jù)庫,是鑒別雜交水稻親本、組合及研究子代與親本遺傳關系的有力工具,有助于對雜交水稻骨干親本的科學評價、合理利用,并可對其雜交組合的預測和鑒定提供支持。同時對優(yōu)異雜交水稻品種或材料實施產(chǎn)權保護亦具有十分重大的意義。本研究依據(jù)相關的國家和行業(yè)技術標準所推薦的SSR核心引物和規(guī)定的技術方法1材料和方法1.1常規(guī)品種株用于構建分子身份證的133個雜交水稻親本(含部分常規(guī)品種)包括15個秈型三系不育系、18個秈型兩系不育系、70個秈型恢復系及品種、5個粳型三系不育系、2個粳型兩系不育系、23個粳型恢復系及品種。1.2種子采集、dna提取樣品種子由相關育種單位提供,收集后系統(tǒng)編號,于海南省陵水縣(安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所南繁育種基地)隔離繁殖,嚴格去雜后收獲種子,正季于合肥(安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所崗集試驗基地)統(tǒng)一種植,每個品種栽插5行,每行11株,分蘗盛期剪取幼嫩葉片,用于提取基因組DNA,成株期對單株形態(tài)拍照記錄。1.3母材料的ssr分析48對SSR核心引物的詳細信息見表2,水稻葉片DNA提取、SSR擴增和擴增產(chǎn)物的電泳檢測均按標準規(guī)定的方法進行1.4ssr指紋數(shù)據(jù)庫構建根據(jù)48對核心引物在133個水稻親本材料中的擴增結果,排定每對引物擴增產(chǎn)物分子量梯度,依照48對引物擴增產(chǎn)物分子量梯度,構建各品種材料的分子身份證(由48位數(shù)字或數(shù)字與字母組成),并以坐標圖的形式顯示品種指紋圖譜,最后以親本材料的分子身份證、指紋圖譜、主要農(nóng)藝性狀及單株照片等信息為基礎,構建具有查找和比對功能的雜交水稻親本材料SSR指紋數(shù)據(jù)庫。2結果與分析2.1水稻品種遺傳相似性及亞群分析48對引物在133份水稻材料中擴增片段大小范圍在80~300bp,多態(tài)性片段數(shù)為2~13個(表1),多態(tài)信息含量PIC值為0.3526~0.8438,平均0.6218。對133份水稻材料進行聚類分析(圖1),結果表明,品種間遺傳相似系數(shù)為0.76~0.98,遺傳變異較小,表明水稻親本品種遺傳相似性較高,遺傳基礎較為狹窄。以相似系數(shù)0.78為閾值,可以將133個供試品種分為2個類群,第Ⅰ類群主要為秈稻品種,包括108個品種,第Ⅱ類群主要為粳稻品種,包括25個品種。Ⅰ類群在遺傳相似系數(shù)為0.83處,可分為4個亞群:ⅠA亞群主要為秈型三系不育系,ⅠB亞群主要為秈型兩系不育系,ⅠC亞群主要為秈型恢復系及秈型常規(guī)品種,ⅠD亞群主要為秈稻中的偏粳類型與粳稻中的偏秈類型。第Ⅱ類群在相似系數(shù)為0.84處,可分為2個亞群,ⅡB亞群為粳稻常規(guī)品種,其余粳稻品種歸為ⅡA亞群。表明48對SSR核心引物在133份材料中表現(xiàn)出較高的區(qū)分能力。2.2擴增產(chǎn)物的等位基因編碼根據(jù)標記引物擴增片段與分子量標準的相對遷移率,記錄每個引物在133份材料中擴增的等位基因數(shù)和片段大小,并按分子量排成階梯圖(圖2),從大到小以阿拉伯數(shù)字1、2、3、4、……、9標注,9個以上的等位基因,以大寫英文字母A、B、C、……、Z標注。2.3-32a分子身份證的構建每個水稻親本用一組48位數(shù)字或數(shù)字與字母的組合來表示其對核心引物的擴增結果,作為該品種的分子身份證,表2列出了48對引物在7個不育系上擴增的特征條帶即分子身份證,如Ⅱ-32A的分子身份證即可表示為:641726772422154452421331732547185233373124151722,該分子身份證的第1位數(shù)字“6”表示Ⅱ-32A在1號引物RM1(表1)上擴增出在分子量梯度圖中(圖2)排第6位的片段;第2位數(shù)字“4”表示Ⅱ-32A在2號引物RM9上擴增出在分子量梯度圖中排第4位的片段,其余46位以此類推。133份雜交水稻親本材料的分子身份證具體見表2。2.4標識的等位基因編碼133份水稻品種的指紋圖譜均采用坐標圖的形式表示,橫坐標表示所使用的48對核心引物,縱坐標表示等位基因分子量梯度(與2.2中含義描述相同),以數(shù)字(或字母)表示,指紋圖左上角標識品種名稱,圖3以“Ⅱ-32A”為例。2.5ssr指紋數(shù)據(jù)庫構建以雜交水稻的親本分子身份證信息、指紋圖譜、主要農(nóng)藝性狀及單株照片等信息為基礎,以品種名稱、核心標記、分子身份證為基本要素,構建具有查詢和比對功能的“水稻親本DNA指紋及性狀數(shù)據(jù)庫”(:8080/ricedbqb.nsf)。2.6水稻親水性絲魯酯數(shù)據(jù)庫功能SSR指紋數(shù)據(jù)庫具有品種基本信息查詢、分子身份證查詢、品種間相似率查詢和身份證核對等基本功能及其他拓展功能。2.6.1品種信息編碼輸入品種名稱,即可顯示該品種的基本信息,包括品種名稱、品種類型、選育單位、親本來源、特征特性、應用情況、品種圖片、分子身份證和指紋圖譜等。2.6.2相似度最高的品種輸入品種48位分子身份證,系統(tǒng)提示具該身份證的品種是否在庫,同時給出相似度最高的5個品種。如果輸入受檢新品種的系統(tǒng)檢測資料(按國標推薦的引物和方法),可自動生成其相應的48位分子身份證,并提示該品種是否在庫,同時給出與其相似度最高的5個品種。2.6.3兩縣雜交稻分子身份證的構建輸入2個在庫品種名稱,可查詢品種間分子身份證相似率或進行品種分子身份證核對。本研究構建的雜交水稻親本指紋數(shù)據(jù)庫可用于水稻品種真實性和純度的分子鑒定:通過將受檢親本樣品與標準親本的指紋圖譜比對,進行雜交水稻親本的真實性鑒定。將本數(shù)據(jù)庫不育系與恢復系的分子身份證相加,可推導出其組合的理論雜交稻分子身份證;同理,通過雜交稻組合中的雜合帶型與其任一親本的分子身份證相減,可得到另一親本的分子身份證,通過指紋圖譜比對,即可進行水稻雜交種純度、真實性及親子鑒定。另外,通過不同親本品種間的指紋圖譜分析與比較,了解其遺傳相似性,可為雜交稻新組合的選育提供親本選配的參考。3ssr標記多態(tài)性分析農(nóng)作物品種分子身份證不僅要區(qū)分品種,而且要求非常高的可重復性和簡便性。由于SSR標記方法具有操作簡便快捷、多態(tài)性高和穩(wěn)定性好等特性,非常適合于構建農(nóng)作物品種分子身份證。本研究利用48對核心標記,對133份水稻親本材料進行遺傳多樣性分析,聚類結果較好地反映了品種間的親緣關系,秈稻與粳稻聚類于不同的類群,品種間有較大的遺傳差異;不育系與恢復系(常規(guī)品種)又聚類于不同的亞群,品種間表現(xiàn)了較小的遺傳差異,這與前人的研究結果相一致本研究建立的指紋數(shù)據(jù)庫,是依據(jù)雜交水稻親本材料的SSR擴增產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳基礎上獲得的,引物擴增產(chǎn)物等位分子量梯度主要依靠人工比對獲得。隨著分析檢測技術的進步和普及,SSR擴增產(chǎn)物的片段大小可以借助基因分析儀進行直接讀取利用SSR標記構建品種分子身份證雖有