酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)( ELISA )Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay

酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）

Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay一、ELISA簡介二、ELISA原理三、ELISA分類四、ELISA相關(guān)試劑五、ELISA影響因素六、ELISA應(yīng)用一、ELISA簡介1971年瑞典學(xué)者Engvall和Perlmann，荷蘭學(xué)者VanWeeman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，ELISA）。自上世紀(jì)70年代初問世以來，ELISA發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。二、ELISA原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。YY

①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）

②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）抗原凡是能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞并能與之結(jié)合引起特異性反應(yīng)的物質(zhì)稱為抗原（antigen）?？乖姆肿咏Y(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，但抗原分子的活性和特異性并不是決定于整個(gè)抗原分子，決定其免疫活性的只是其中的一小部分抗原區(qū)域?？乖肿颖砻婢哂刑厥饬Ⅲw構(gòu)型和免疫活性的化學(xué)基團(tuán)稱為抗原決定簇（antigenicdeterminant）或抗原決定基。抗體動物機(jī)體受到抗原物質(zhì)刺激后，由B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞產(chǎn)生的，能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白，這類免疫球蛋白稱為抗體（antibody，Ab）。免疫球蛋白是蛋白質(zhì)，因此一種動物的免疫球蛋白對另一種動物而言是良好的抗原。免疫球蛋白不僅在異種動物之間具有抗原性，而且在同一種屬動物不同個(gè)體之間，以及自身體內(nèi)同樣是一種抗原物質(zhì)。免疫標(biāo)記技術(shù)放射物標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)技術(shù)免疫熒光技術(shù)其他標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法競爭法雙抗原夾心法間接法三、ELISA分類雙抗體夾心法競爭法間接法ELISA基本實(shí)驗(yàn)過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色實(shí)驗(yàn)中對照的設(shè)置陽性對照陰性對照空白對照臨界標(biāo)準(zhǔn)品四、ELISA相關(guān)試劑01.印跡膜02.封閉液03.樣品稀釋液04.濃縮洗滌液（10X）05.酶聯(lián)物06.AP底物07.八孔板08.判讀卡09.記錄紙10.說明書01、微孔反應(yīng)板02、酶聯(lián)物03、TMB底物04、樣品稀釋液05、濃縮洗滌液（10X）06、終止液07、陽性質(zhì)控物08、陰性質(zhì)控物09、臨界質(zhì)控物10、說明書ELISA試劑（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液。固相抗原或抗體1、固相載體的性狀固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。ELISA載體的形狀主要有：膜（NC膜、PVDF膜、尼龍膜）、微量滴定板（96孔板）、小珠和小試管，以微量滴定板（96孔板）最為常用。良好的ELISA用96孔板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。2、包被用抗原用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。3、包被條件酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）1、酶用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：（1）純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價(jià)格不貴；（2）制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力；（3）在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶；（4）相應(yīng)底物易于制備和保存，價(jià)格低廉；（5）有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。常用的酶為辣根過氧化物（horseradishperoxidase，HRP）和堿性磷酸酶（alkalinephosohatase，AP）。酶底物顯色反應(yīng)測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

2、抗原和抗體制備結(jié)合物時(shí)所用抗體一般均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。3、結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。4、結(jié)合物的保存酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右。酶的底物1、HRP的底物HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，常用的供氫體有鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和ABTS。TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，無致癌性等優(yōu)點(diǎn)。酶反應(yīng)用HCl或H2SO4

終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，2、AP的底物AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯（p‐NPP）作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。NBT/BCIP，紫色反應(yīng)，水沖洗終止反應(yīng)。

試劑因素標(biāo)本因素實(shí)驗(yàn)原理或操作方法環(huán)境因素五、ELISA影響因素●抗原抗體的純度●標(biāo)準(zhǔn)品定值的準(zhǔn)確性●抗體的親和力、滴度和特異性●標(biāo)記物的比活性或免疫活性

試劑因素

內(nèi)源性物質(zhì)常見的有:類風(fēng)濕因子（RF）、嗜異性抗體（Id）、補(bǔ)體、人抗動物抗體（HAAA）、藥物及其導(dǎo)致的代謝產(chǎn)物和交叉反應(yīng)物質(zhì)等。外源性物質(zhì)主要為：標(biāo)本溶血、標(biāo)本細(xì)菌污染、標(biāo)本儲存時(shí)間過長、標(biāo)本凝集不全和采血管中含有添加劑等。自身免疫產(chǎn)品：膽紅素濃度小于0.05mg/mL的黃疸，血紅蛋白濃度小于5.0mg/mL的溶血和甘油三酯濃度小于25.0mg/mL的脂血對檢測結(jié)果沒有影響。

標(biāo)本因素鉤狀效應(yīng)（HOOK效應(yīng)）及交叉反應(yīng)現(xiàn)象顏色終止條件

ELISA實(shí)驗(yàn)終止劑選用引起的持續(xù)發(fā)展的顏色加深影響了陰性和弱陽性樣品及定量檢測樣品的結(jié)果,特別在大批樣品需較長時(shí)間進(jìn)行讀數(shù)時(shí),這種潛在的顏色逐漸加深現(xiàn)象成為結(jié)果影響的重要因素。ELISA的洗板過程

洗液沖力過大會造成酶結(jié)合物丟失,本底偏淺,