微生物分離純化（食品微生物課件）

情境：分離純化技術(shù)任務(wù)：分離純化培養(yǎng)知識(shí)點(diǎn)：常用分離純化技術(shù)課程：食品微生物技術(shù)平板劃線分離1.目的了解平板劃線法分離菌種的基本原理；練習(xí)平板劃線法分離菌種的基本操作；掌握無菌操作技術(shù)。2.原理平板劃線分離法，是指把雜菌樣品通過在平板表面劃線、稀釋而獲得單菌落的方法。一般是將混雜在一起的不同種微生物或同種微生物群體中的不同細(xì)胞，通過在分區(qū)的平板表面上作多次劃線稀釋，形成較多的獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)而繁殖成相互獨(dú)立的多個(gè)單菌落。一、平板劃線分離通常認(rèn)為這種單菌落就是某微生物的“純種”。實(shí)際上同種微生物數(shù)個(gè)細(xì)胞在一起通過繁殖也可形成一個(gè)單菌落，故在科學(xué)研究中，特別是在菌種鑒定等工作中，必須對(duì)實(shí)驗(yàn)菌種的單菌落進(jìn)行多次劃線分離，才可獲得可靠的純種。

平板劃線分離對(duì)細(xì)菌、酵母菌較為適宜。具體的劃線形式有多種，常用方法：將一個(gè)平板分成A、B、C、D4個(gè)面積不同的小區(qū)進(jìn)行劃線，A區(qū)面積最小，作為待分離菌的菌源區(qū)，B和C區(qū)為經(jīng)初步劃線稀釋的過渡區(qū)，D區(qū)則是關(guān)鍵的單菌落收獲區(qū)，它的面積最大，出現(xiàn)單菌落的概率也最高。3.材料和器皿（1）菌種

大腸埃希氏菌（Escherichia

coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus

subtilis）的混合培養(yǎng)斜面菌種。（2）培養(yǎng)基伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基。（3）器皿無菌培養(yǎng)皿，水浴鍋，接種環(huán)，培養(yǎng)箱等。

4.方法步驟（1）融化培養(yǎng)基將裝有伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶放入熱水浴中加熱至沸，直至充分融化。（2）倒平板待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右后，按無菌操作法倒平板（每皿約倒15ml），平置，待凝。操作方法：右手持盛培養(yǎng)基的三角瓶置火焰旁邊，用右手手掌和小指將瓶塞輕輕地拔出，瓶口保持對(duì)著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一條稍大于瓶口的縫隙，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。（3）劃線操作①挑取菌樣：選用平整、圓滑的接種環(huán)，按無菌操作法挑取少量含菌試樣。②先劃A區(qū)：將平板倒置于酒精燈火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并讓平板面向火焰。右手持含菌的接種環(huán)，先在A區(qū)輕巧地劃3~4條連續(xù)的平行線當(dāng)作初步稀釋的菌源。燒去接種環(huán)上的殘余菌樣。

③劃其余區(qū)：將燒去殘菌后的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基邊緣冷卻一下，并使B區(qū)轉(zhuǎn)至劃線位置，把接種環(huán)通過A區(qū)（菌源區(qū)）而移至B區(qū)，隨即在B區(qū)輕巧地劃上6~7條致密的平行線，接著再以同樣的操作在C區(qū)和D區(qū)劃上更多的平行線，并使D區(qū)的線條與A區(qū)平行（但不能與A區(qū)或B區(qū)的線條接觸?。?，最后，將左手所持皿底放回皿蓋中。燒去接種環(huán)上的殘菌。（4）恒溫培養(yǎng)將劃線后的平板至37℃倒置培養(yǎng)2~3天。（5）挑單菌落良好的結(jié)果應(yīng)在C區(qū)出現(xiàn)部分單菌落，而在D區(qū)出現(xiàn)較多獨(dú)立分布的單菌落。然后從典型的單菌落中挑取少量菌體至試管斜面，經(jīng)培養(yǎng)后即為初步分離的純種。（6）清洗、處理清洗培養(yǎng)皿，將廢棄的帶菌平板作煮沸殺菌后進(jìn)行清洗、晾干。

5.注意事項(xiàng)

①平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。為防止平板表面產(chǎn)生冷凝水，倒平板前培養(yǎng)基溫度不能太高。

②用于平板劃線的培養(yǎng)基，瓊脂含量宜高些（2%左右），否則會(huì)因平板太軟而被劃破。

③用于劃線的接種環(huán)，環(huán)柄宜長(zhǎng)些（約10cm），環(huán)口應(yīng)十分圓滑，劃線時(shí)環(huán)口與平板間的夾角宜小些，動(dòng)作要輕巧，以防劃破平板。

④為了取得良好的劃線效果，可事先用圓紙墊在空培養(yǎng)皿內(nèi)畫上4區(qū)，并用接種環(huán)練習(xí)劃線動(dòng)作，待通過模擬試驗(yàn)熟練操作和掌握劃線要領(lǐng)后，再正式進(jìn)行平板劃線。涂布分離培養(yǎng)技術(shù)三、涂布分離培養(yǎng)技術(shù)1、定義及特點(diǎn)將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落。優(yōu)點(diǎn)：可以計(jì)數(shù)，可以觀察菌落特征。缺點(diǎn)：吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延。一般用于平板培養(yǎng)基的回收率計(jì)數(shù)。例如：測(cè)定純凈水中大腸桿菌的含量。一、涂布分離培養(yǎng)技術(shù)2、操作方法用移液管或移液槍分別取適合稀釋度液（一般取3個(gè)梯度）1mL于倒好培養(yǎng)基且凝固好的培養(yǎng)皿中，用無菌涂布棒將稀釋液充分涂開，待干。每個(gè)稀釋梯度一般2~3個(gè)平行。稀釋平板分離培養(yǎng)技術(shù)二、稀釋平板分離培養(yǎng)技術(shù)稀釋平板分離法

首先把微生物懸液作一系列