電鏡生物樣品制備技術(shù)課件

第五章掃描電鏡生物樣品制備技術(shù)第五章掃描電鏡生物樣品制備技術(shù)1電鏡生物樣品制備技術(shù)ppt課件2第一節(jié)常規(guī)生物樣品SEM制備技術(shù)第一節(jié)常規(guī)生物樣品SEM制備技術(shù)3FeaturesofSEM高分辨率FeaturesofSEM高分辨率4FeaturesofSEM強(qiáng)立體感FeaturesofSEM強(qiáng)立體感5FeaturesofSEM廣泛的放大倍率FeaturesofSEM廣泛的放大倍率6FeaturesofSEM應(yīng)用范圍廣生物、醫(yī)學(xué)、動物、材料、化學(xué)、物理、地質(zhì)、冶金、礦物、污泥(桿菌)、機(jī)械、電機(jī)及導(dǎo)電性樣品如半導(dǎo)體電子材料等FeaturesofSEM應(yīng)用范圍廣生物、醫(yī)學(xué)、動物、材7材料學(xué)土聚水泥材料學(xué)土聚水泥8

制備掃描電鏡樣品的總要求

在不損傷樣品原始結(jié)構(gòu)狀態(tài)的情況下，保證樣品的體積和表面積不發(fā)生改變，充分暴露樣品表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)。制備掃描電鏡樣品的總要求9生物樣品的特性含水量高質(zhì)地柔軟導(dǎo)電性差二次電子產(chǎn)率低對熱、電子束等敏感生物樣品的特性含水量高10掃描電鏡生物樣品要求：不含水份具有較高的二次電子發(fā)射率良好的導(dǎo)電性耐熱性最大限度的保持樣品的形貌掃描電鏡生物樣品要求：11

掃描電鏡樣品常規(guī)制備的操作程序

1.取材2.清洗3.

固定4.

脫水5.

干燥（置換）6.

粘托7.

鍍膜（導(dǎo)電處理）掃描電鏡樣品常規(guī)制備的操作程序12

一、

取材

要點(diǎn)：確定觀察樣品的目標(biāo)要求及注意事項：做好充分準(zhǔn)備（試劑、儀器、器械等）保護(hù)觀察面，作好標(biāo)記速度要快，每次取材數(shù)量不宜過多大小要合適10×10×5毫米避免拉割、擠壓一、取材13二、清洗目的：去除觀察面的雜質(zhì)，充分暴露觀察面方法：物理方法:漂洗、換洗、加壓沖洗、振蕩超聲。

化學(xué)方法:用酶消化法注意事項：

在保證不破壞觀察面的條件下，充分暴露觀察面不要損傷觀察面或者使樣品膨脹、收縮等不要將樣品裸露在空間，防止樣品皺縮變型二、清洗14清洗液的選擇一般組織：等滲生理鹽水游離組織細(xì)胞：緩沖液、等張液表面覆有大量黏液的組織（如胃腸粘膜）：低濃度蛋白水解酶組織培養(yǎng)細(xì)胞：組織培養(yǎng)液特殊樣品：特殊洗液（如生藥表面的蠟質(zhì)，選用去垢劑TritonX-100）清洗液的選擇一般組織：等滲生理鹽水15三、

固定目的：

保存樣品表面的真實結(jié)構(gòu)；

硬化組織，減少脫水干燥時水的表面張力對樣品的損傷；

提高樣品的二次電子發(fā)射率；

提高樣品的耐熱性和導(dǎo)電性。常用的固定劑：

2.5%戊二醛（1～3h)1.0%四氧化鋨(30’~1h)固定溫度：

室溫，一般以4℃為宜。三、固定16四、脫水

要求：不改變樣品的體積和表面積的情況

下，去除樣品中的水份。常用的脫水劑：乙醇、丙酮方法：梯度脫水時間：視樣品大小而定注意事項：避免裸露，夾傷四、脫水17五、干燥目的：去除樣品中的脫水劑

方法：空氣干燥法、冷凍干燥法、

叔丁醇干燥法、臨界點(diǎn)干燥法等常用干燥法：叔丁醇干燥法、臨界點(diǎn)干燥法五、干燥18空氣干燥法方法：脫水至無水狀態(tài)，為減緩其揮發(fā)速度，退回至85%脫水劑，取出，空氣中自然干燥。優(yōu)點(diǎn)：脫水劑為低表面張力物質(zhì)，揮發(fā)過程中減少了樣品的收縮及損傷缺點(diǎn)：常常使樣品發(fā)生變形收縮適用范圍：鑄型或體表比較堅硬的甲殼昆蟲等含水量較少的樣品空氣干燥法方法：脫水至無水狀態(tài)，為減緩其揮發(fā)速度，退回至8519冷凍干燥法方法：將含大量水分的生物樣品迅速投入液氮中，使樣品冷凍固化，而后將樣品移入真空鍍膜儀內(nèi)，在高真空狀態(tài)下升華，脫水劑直接由固態(tài)轉(zhuǎn)為氣態(tài)，樣品隨之得到干燥。優(yōu)點(diǎn)：不存在氣相與液相間的表面張力問題，故對樣品損傷較小。缺點(diǎn)：需特殊的低溫條件，易出現(xiàn)冰晶損傷，費(fèi)時。適用范圍：含水量較多的生物樣品冷凍干燥法方法：將含大量水分的生物樣品迅速投入液氮中，使樣品20叔丁醇干燥法（1）乙醇梯度脫水至100﹪/2次（2）叔丁醇與乙醇混合液置換至100%叔丁醇70﹪、80﹪、90﹪、95﹪和100﹪/2次5-10min/次（3）在樣品表面滴上100%叔丁醇（4）將標(biāo)本置于4℃以下使樣品快速固化（5）移入鍍膜儀中讓樣品在真空下升華干燥。叔丁醇干燥法21臨界點(diǎn)干燥法

原理：利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時，氣相與液相的界面消失，樣品在沒有表面張力的情況下進(jìn)行干燥。步驟：脫水置換（醋酸異戊酯）預(yù)冷放入樣品注入液態(tài)CO2CO2置換CO2加溫氣化排除CO2溫度：31.4度壓力：73個大氣壓臨界點(diǎn)干燥法22臨界點(diǎn)干燥法空氣干燥法臨界點(diǎn)干燥法空氣干燥法23

ComparisonbetweencriticalpointdryingandairdryingComparisonbetweencritical24

六、粘托

SEM樣品在干燥處理或金屬鍍膜之前，需用特制導(dǎo)電膠或雙面膠將樣品粘貼在金屬樣品臺上。

導(dǎo)電膠一般具有黏著力較強(qiáng)、容易揮發(fā)固化、干燥后表面電阻率低、導(dǎo)電性能好等特點(diǎn)。

要點(diǎn)：穩(wěn)，鈍角六、粘托25樣品粘托Fixingthespecimen

樣品粘托26七、鍍膜（樣品的導(dǎo)電處理）目的：使樣品導(dǎo)電，增加二次電子的發(fā)射率金屬鍍膜技術(shù)：包括真空噴鍍法和離子濺射法七、鍍膜（樣品的導(dǎo)電處理）27真空噴鍍法

方法：在高真空中使金屬加熱蒸發(fā)，在

樣品表面沉積形成一層金屬膜。缺點(diǎn)：金屬損耗大，容易產(chǎn)生污染和熱

損傷，容易形成“死角”。

真空噴鍍法28電鏡生物樣品制備技術(shù)ppt課件29離子濺射法原理：利用氣體在低真空中的輝光放電所產(chǎn)生的高能離子，對靶極產(chǎn)生撞擊，從靶極上打出金屬粒子，金屬粒子在電場的作用下飛向樣品。在到達(dá)樣品前，金屬粒子之間以及金屬粒子與氣體分子之間要發(fā)生相互撞擊，改變了金屬粒子飛向樣品的方向，具有“繞射”效應(yīng)，所以在樣品表面能形成一層連續(xù)的、厚度均勻的金屬膜。離子濺射法30電鏡生物樣品制備技術(shù)ppt課件31離子濺射的優(yōu)點(diǎn)：要求的真空低工作溫度低金屬粒子無方向連續(xù)的、厚度均勻離子濺射的優(yōu)點(diǎn)：32電鏡生物樣品制備技術(shù)ppt課件33甲蟲3kV甲蟲3kV34電鏡生物樣品制備技術(shù)ppt課件35大腸桿菌耳蝸大腸桿菌耳蝸36尿酸鈉結(jié)晶紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞吞噬尿酸鈉結(jié)晶紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞吞噬37上左：兔腎小體細(xì)胞上右：血細(xì)胞發(fā)生下圖：十二指腸絨毛上左：兔腎小體細(xì)胞38

SEM觀察苗木下表皮氣孔分佈及葉部組織之微細(xì)構(gòu)造

A：氣孔密度(橫線=120mm)

B：氣孔形態(tài)(橫線=12mm)C：葉組織(橫線=120mm)ABCSEM觀察苗木下表皮氣孔分佈及葉部組織之微細(xì)構(gòu)造ABC39SEM觀察泡桐根瘤線蟲微細(xì)構(gòu)造SEM觀察泡桐根瘤線蟲微細(xì)構(gòu)造40SEM觀察A.scrobiculata孢子之外觀形態(tài)(橫線=60mm)SEM觀察G.mosseae叢枝菌根真菌

孢子之外觀形態(tài)(橫線=100mm)SEM觀察A.scrobiculata孢子之外觀形態(tài)SE41接種菌根菌及2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細(xì)構(gòu)造(A：橫線=30mm；B：橫線=12mm)未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細(xì)構(gòu)造(A：橫線=300mm；B：橫線=12mm)接種菌根菌及2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細(xì)構(gòu)造未接種菌根菌42TRRT

T.harzianum(T)寄生在立枯絲核菌(R)菌株上的情形TRRTT.harzianum(T)寄生在立枯絲核菌(43松材線蟲頭部口針?biāo)刹木€蟲(雄)松材線蟲(雌)松材線蟲頭部口針?biāo)刹木€蟲(雄)松材線蟲(雌)44白粉病分生孢子麻竹墊銹菌孢子白粉病分生孢子麻竹墊銹菌孢子45第二節(jié)

掃描電鏡特殊樣品制備技術(shù)特殊生物樣品制備主要有：（1）管道鑄型樣品（2）冷凍斷裂樣品（3）游離細(xì)胞樣品（4）組織消化樣品第二節(jié)掃描電鏡特殊樣品制備技術(shù)461.管道鑄型樣品用于研究血管淋巴管膽管等空腔性臟器的立體結(jié)構(gòu)關(guān)系和內(nèi)表面結(jié)構(gòu)。鑄型方法:鑄型劑灌入管腔硬化成型后將組織腐蝕去掉處理鑄型進(jìn)行觀察鑄型處理：干燥

噴鍍

觀察1.管道鑄型樣品47電鏡生物樣品制備技術(shù)ppt課件48電鏡生物樣品制備技術(shù)ppt課件492冷凍斷裂樣品用于實質(zhì)性臟器內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的研究，觀察組織細(xì)胞內(nèi)部各種復(fù)雜的細(xì)胞器及相互之間的關(guān)系。步驟：取材固定清洗防凍冷凍包埋割斷軟化后固定導(dǎo)電及終末固定脫水臨界點(diǎn)干燥鍍膜

觀察要求：取材迅速，大小為1×1×5mm，用具要預(yù)冷，切忌夾持觀察面，冷凍的速度要快，外力要輕2冷凍斷裂樣品50電鏡生物樣品制備技術(shù)ppt課件51電鏡生物樣品制備技術(shù)ppt課件523游離細(xì)胞樣品樣品制備要點(diǎn)：將相對低濃度、分散、游離的細(xì)胞濃縮、集中、固定步驟：預(yù)固定離心涂片固定脫水干燥鍍膜電鏡