狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件

1.臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室診斷

實(shí)驗(yàn)室手段對(duì)狂犬病的確診非常必要。ＷＨＯ要求狂犬病病例的統(tǒng)計(jì)上報(bào)資料要注明診斷的依據(jù)（是否包括實(shí)驗(yàn)室診斷？）。目前國際上公認(rèn)狂犬病的死亡率是100%，原則上不承認(rèn)有狂犬病康復(fù)的可能，即狂犬病的發(fā)病率應(yīng)與死亡率相等。沒有合格實(shí)驗(yàn)室給出的肯定診斷的康復(fù)病例應(yīng)從狂犬病病例的統(tǒng)計(jì)數(shù)字中剔除。“狂犬病患者必死無疑，不死不算狂犬病”，要挑戰(zhàn)這個(gè)命題，必須提供確切、完整的病史和權(quán)威的實(shí)驗(yàn)室診斷資料。1.臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室診斷實(shí)驗(yàn)室手段12.人狂犬病的生存期內(nèi)診斷

生存期內(nèi)的診斷技術(shù)的選擇主要隨著病程的不同而異。在病后最初幾天，檢測抗原一般是敏感的。腦脊液及血清中的病毒中和抗體常常趨向于在病后7—10天出現(xiàn)。檢測抗原可用熒光抗體（FA）法檢查狂犬病患者角膜印片或皮膚活組織，但是，F(xiàn)A陽性標(biāo)本在發(fā)病的后期更常見。皮膚活組織檢查常常從頸背部取含有末稍神經(jīng)的帶有毛囊的標(biāo)本。角膜印片(切勿劃痕)取自伴有腦炎的患者，用顯微鏡的載波片輕輕觸及角膜的中心部位。角膜印片及皮膚活組織標(biāo)本的質(zhì)量很重要，采取后應(yīng)立即冷凍，直至檢測。不過，用FA技術(shù)做生存期內(nèi)的診斷，其敏感性是有限的。2.人狂犬病的生存期內(nèi)診斷生存期內(nèi)的診斷技術(shù)2

人狂犬病的生存期內(nèi)診斷

已證實(shí)患者及自然感染和實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物的角膜印片中存在狂犬病抗原。但是，角膜印片檢出率較低，陽性結(jié)果可肯定是狂犬病，而陰性結(jié)果并不能排除是狂犬病的可能。雖然在臨床癥狀開始時(shí)，在皮膚活組織中可能檢出狂犬病抗原，但早期癥狀時(shí)僅有25-50%的患者為陽性，隨著病情的進(jìn)展陽性率也增加。頸背部皮膚活組織檢查只有一些患者呈陽性結(jié)果，特別是在臨床疾病的早期。用FA檢查皮膚活組織的靈敏度一般高于檢查角膜印片。人狂犬病的生存期內(nèi)診斷已證實(shí)患者及自然感染33.動(dòng)物和人狂犬病的死后診斷

抗原檢測病毒分離病毒鑒定等。為了確保實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的可信性，必需滿足若干條件：

1.標(biāo)本質(zhì)量要好；

2.標(biāo)本送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的條件要好（符合GLP標(biāo)準(zhǔn)，獲得一定級(jí)別的資格認(rèn)證）；

3.獲得結(jié)果的等待時(shí)間要短；

4.結(jié)果的傳遞要迅速。3.動(dòng)物和人狂犬病的死后診斷

抗原檢測4二狂犬病診斷實(shí)驗(yàn)室的安全措施1.危險(xiǎn)性

在一般的實(shí)驗(yàn)室條件，技術(shù)人員暴露于以下傳染的危險(xiǎn)：

——野生狂犬病毒(即街毒)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)接收到的動(dòng)物標(biāo)本進(jìn)行尸體解剖時(shí)或?qū)?biāo)本進(jìn)行加工時(shí)(懸液制備，離心)等，這一類操作是非常危險(xiǎn)的，必須在P3以上條件的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

——實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)的病毒(即固定毒)，當(dāng)接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或操作感染的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，特別是制備大量的高濃度病毒時(shí)，主要的傳染來源為手指被有感染的玻璃或工具刺傷或割破；新糜爛的皮膚或粘膜與感染物接觸也應(yīng)認(rèn)為是一種傳染的危險(xiǎn)。雖然固定毒的毒力已大為下降，歷史上僅有一例死于固定毒操作的報(bào)道，但仍有一定的危險(xiǎn)性，因此操作固定毒仍須十分小心。二狂犬病診斷實(shí)驗(yàn)室的安全措施1.危險(xiǎn)性5生物安全級(jí)別＆對(duì)工作人員的要求

(BiologicalSafetyLevel,BSL)(Protection,P)

BSL-1：實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)程序方面受過特殊訓(xùn)練，由受過微生物學(xué)或相關(guān)科學(xué)一般訓(xùn)練的科學(xué)工作者監(jiān)督實(shí)驗(yàn)。

BSL-2：實(shí)驗(yàn)人員均接受過病源處理方面的特殊培訓(xùn)，并由有資格的科學(xué)工作者指導(dǎo)。

BSL-3：實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)在處理致病性的和可能使人致死的病源方面受過專業(yè)訓(xùn)練，并由對(duì)該病源工作有經(jīng)驗(yàn)的、有資格的科學(xué)工作者監(jiān)督。

BSL-4：實(shí)驗(yàn)室成員應(yīng)在處理特別危險(xiǎn)的傳染源方面受過特殊和全面的訓(xùn)練，應(yīng)了解標(biāo)準(zhǔn)和特殊操作中一級(jí)和二級(jí)遏制的作用、遏制設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)性能。實(shí)驗(yàn)由在有關(guān)病源方面受過訓(xùn)練、并有工作經(jīng)驗(yàn)的、有資格的科學(xué)工作者監(jiān)督。生物安全級(jí)別＆對(duì)工作人員的要求

(Biologi62.對(duì)安全操作的建議

操作所有潛在狂犬病感染的材料均應(yīng)在

P2或P3生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

對(duì)狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷的安全性要求：

①一個(gè)封閉的環(huán)境，專作狂犬病感染性工作②通過緩沖更衣間并限制一定的專業(yè)人員進(jìn)入；③穿專用的實(shí)驗(yàn)室隔離無菌衣和鞋；④操作完畢對(duì)操作臺(tái)進(jìn)行消毒(當(dāng)材料偶然地溢出時(shí)應(yīng)立即用3％的雷蘇爾溶液或其他相應(yīng)的消毒劑消毒)；⑤每日應(yīng)至少消毒地板一次；⑥所有用后剩余的標(biāo)本，尸解工具，實(shí)驗(yàn)室材料在拿出實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)進(jìn)行高壓蒸氣消毒。在生物安全柜或隔離器內(nèi)打開動(dòng)物顱蓋骨的操作很困難，技術(shù)人員在操作這項(xiàng)工作時(shí)應(yīng)帶面罩，護(hù)目鏡、手套和圍裙。由于與狂犬病相關(guān)病毒對(duì)人的致病性還不很了解，所有操作可能含有這些病毒的標(biāo)本均應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)室工作人員務(wù)必進(jìn)行狂犬病疫苗的暴露前免疫，這些人員的中和抗體應(yīng)定期檢查，所有意外地暴露于感染時(shí)必需立即報(bào)告負(fù)責(zé)人。2.對(duì)安全操作的建議操作所有潛在狂犬病感染的材料均7n＝待測疫苗效力的最低合格要求（IU/ml）。(1)用注射器或吸管吸入法采集唾液(不用棉拭)，CSF，皮膚活檢等樣品。再經(jīng)24小時(shí)溫育后,細(xì)胞單層用丙酮固定,用熒光標(biāo)記的抗NP抗體染色,以檢測未被中和的病毒的存在(熒光灶FFU)。此稀釋度可由以下公式計(jì)算決定：(1)枕部途徑：360.216.2)標(biāo)本取自死亡后的個(gè)體2）快速凝集法（RAT）：*3份為狂躁型，1份為麻痹型我們將同一份CVS毒種分裝保存于一70℃，在半年時(shí)間內(nèi)重復(fù)測定6次，其滴度相當(dāng)穩(wěn)定（對(duì)于病毒稀釋度1：103.最大優(yōu)點(diǎn)是快速、費(fèi)用低且敏感性和特異性高。建立此方法的另一前提條件是有質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的關(guān)鍵試劑：抗RVNP熒光標(biāo)記抗體。接種96孔已形成單層的BSR細(xì)胞552.25)-log10(2)–log10(2)=0.角膜印片(切勿劃痕)取自伴有腦炎的患者，用顯微鏡的載波片輕輕觸及角膜的中心部位。目前我所已能批量生產(chǎn)這種關(guān)鍵試劑。參考品RFFIT(IU/ml)MNT(IU/ml）1）斑點(diǎn)免疫結(jié)合法（DIA）：1986年由Heberling等建立，用于檢測人血清中狂犬病毒抗體，其結(jié)果與RFFIT具有可比性，但須稍作改進(jìn)以檢測狂犬病毒中和抗體水平。三狂犬病毒抗原的檢測1.標(biāo)本選擇在選擇、運(yùn)送標(biāo)本前，實(shí)際操作獲得標(biāo)本的人員與實(shí)驗(yàn)室檢測人員事先取得聯(lián)系共同選擇實(shí)驗(yàn)方法是很重要的。n＝待測疫苗效力的最低合格要求（IU/ml）。三狂犬81)標(biāo)本取自個(gè)體的生命期

Ａ．檢查病毒和(或)抗原：樣品應(yīng)放在干燥試管內(nèi)。樣品的獲取可按下述方法進(jìn)行。

(1)用注射器或吸管吸入法采集唾液(不用棉拭)，CSF，皮膚活檢等樣品。

(2)角膜涂片，用顯微鏡載玻片直接接觸角膜操作(不要用棉拭)，標(biāo)記玻片，空氣干燥并用鋁錫紙單片包裹。Ｂ。檢測抗體：血液、CSF或血清采集于干燥試管內(nèi)，并低溫冰凍存放。

1)標(biāo)本取自個(gè)體的生命期Ａ．檢查病毒和(或)抗原：樣品應(yīng)92)標(biāo)本取自死亡后的個(gè)體

送至實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本的方式依動(dòng)物種類不同而不同。

(1)小的野生動(dòng)物(包括蝙蝠)

送完整的個(gè)體以便對(duì)動(dòng)物品種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

(2)家養(yǎng)食肉動(dòng)物(狗、貓)或野生食肉動(dòng)物

(狐貍、貉、浣熊、臭鼬、豺等)

僅送頭部。

(3)更大的動(dòng)物(家養(yǎng)或野生食草動(dòng)物)

打開頭蓋骨并取腦送至實(shí)驗(yàn)室。2)標(biāo)本取自死亡后的個(gè)體送至實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本的方式依動(dòng)物種類10標(biāo)本取自死亡后的個(gè)體（人）

對(duì)人狂犬病在有可能進(jìn)行全面尸解時(shí)，把整個(gè)腦取出，或選擇一些部位切下(海馬角、腦干、皮質(zhì)、小腦)送至實(shí)驗(yàn)室。在特殊情況下(困難的野外條件，動(dòng)物流行病學(xué)檢測)以及因宗教或傳統(tǒng)原因?qū)袢∪藷o法尸解時(shí)，可以用塑料管或吸管穿進(jìn)枕骨孔或眼窩后取出一些腦組織)。標(biāo)本取自死亡后的個(gè)體（人）對(duì)人狂犬病在有可能進(jìn)行11

2.標(biāo)本的運(yùn)送

標(biāo)本運(yùn)送必需嚴(yán)格遵循安全要求，包裝務(wù)必要有保證。

1)

可靠的診斷要有一個(gè)保存良好的標(biāo)本；

2)

運(yùn)送狂犬病標(biāo)本的服務(wù)人員應(yīng)事先進(jìn)行過抗狂犬病免疫并證明已得到完全的保護(hù)。

3)小動(dòng)物的軀體或較大動(dòng)物切下的頭部標(biāo)本可用10％甲醛溶液處理過的材料包裹，然后放入一個(gè)厚塑料袋內(nèi)扎緊。如僅取腦(大動(dòng)物)則應(yīng)把腦放人一個(gè)堅(jiān)固的塑料或金屬容器內(nèi)并密封，標(biāo)本作好標(biāo)記，外加第二層包裝并放人泡沫塑料盒中。遠(yuǎn)距離運(yùn)送時(shí)可用干冰保冷。泡沫塑料盒用牢固的粘性帶仔細(xì)封固；把全部有關(guān)標(biāo)本的資料放在信封內(nèi)固定在盒上，再裝進(jìn)一個(gè)紙板箱內(nèi)。箱上應(yīng)清楚地標(biāo)明“小心，有感染性生物材料，狂犬病診斷用生物學(xué)標(biāo)本”字樣。當(dāng)無冷凍條件且標(biāo)本較小時(shí)，可以將小塊腦組織放進(jìn)裝有80％甘油緩沖液的小瓶內(nèi)，以保存其感染性。在無需保存標(biāo)本的感染性，準(zhǔn)備用免疫熒光法檢測抗原時(shí)，則可將腦組織標(biāo)本用10％甲醛固定(固定液內(nèi)應(yīng)含有苦味酸)。2.標(biāo)本的運(yùn)送標(biāo)本運(yùn)送必需嚴(yán)格遵循安全要求，包裝務(wù)必12

3.標(biāo)本的獲取1)動(dòng)物腦組織的獲取

1)將動(dòng)物頭部放在解剖臺(tái)上用骨固定鉗于上頒骨處牢牢固定住，用鋒利的屠刀從眼部至顱骨底部作一中線切割。然后將顳肌從顱部切除，顱蓋骨用割刀和錘子等工具割掉。對(duì)大動(dòng)物可用一外科骨鋸在眼部二側(cè)上方將頭蓋骨橫切，切除腦膜，將髓質(zhì)和腦神經(jīng)切割后，即可將腦取出放在一紙盤或大平皿內(nèi)。3.標(biāo)本的獲取1)動(dòng)物腦組織的獲取13狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件14狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件15狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件16動(dòng)物腦組織的獲取2)特異性病毒包涵體在腦的一些部位更豐富，特別是海馬回，為了暴露海馬回，從一腦半球背面約半球間溝外側(cè)2cm處往下通過灰質(zhì)和白質(zhì)直到側(cè)腦室作一縱切。海馬角像一半園柱形閃光體從腦室底部凸出，小腦和腦干也富有病毒包涵體。當(dāng)標(biāo)本保存不好時(shí)，通常腦干，髓質(zhì)和視神經(jīng)還能保持完好。在常規(guī)的操作中，采集海馬角、一小塊腦干和一小塊皮質(zhì)放在平皿內(nèi)，在底部和上面標(biāo)上標(biāo)本的序號(hào)。平皿立即放置于通風(fēng)柜內(nèi)處理或保存在4℃冷柜內(nèi)。動(dòng)物腦組織的獲取2)特異性病毒包涵體在腦的一些部位17狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件18在《中國生物制品規(guī)程》2000年版中，規(guī)定的狂犬病疫苗的多項(xiàng)檢定均采用小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，如病毒滴定、病毒滅活確證試驗(yàn)以及疫苗效力測定等。泡沫塑料盒用牢固的粘性帶仔細(xì)封固；在“未感染細(xì)胞對(duì)照”孔內(nèi),加入50l培養(yǎng)基。（狗腦）陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)在某些情況下可能難于或不可能尸解以便打開顱骨取腦,為減少這些困難已經(jīng)設(shè)計(jì)出簡便的技術(shù)，即用塑料管插入顱骨采集一小塊腦組織體?！潭〞r(shí)間不宜太長25IU/mlx2ml=2.414.隨著中國改革開放的深入，我國在科研動(dòng)物的使用方面也應(yīng)逐步與國際接軌，今后盡量減少動(dòng)物用量已是大勢所趨。RV的傳統(tǒng)的檢測方法是小鼠動(dòng)物試驗(yàn)。4天后觀察小鼠發(fā)病情況4-6只小白鼠(9-11g重)純化狂犬病毒核衣殼蛋白細(xì)胞無熒光，表明樣品中不含狂犬病毒在選擇RV基因組中的目標(biāo)基因時(shí)，A13.目前我所已能批量生產(chǎn)這種關(guān)鍵試劑。(1)RT-PCR及測序引物快速狂犬病酶免疫診斷法細(xì)胞無熒光，表明樣品中不含狂犬病毒2)唾液腺的獲取

為取出頜下腺，在復(fù)蓋于下頜骨間的皮膚上作一切割，將皮膚往外側(cè)翻，兩側(cè)的頜下腺位于頜骨后部邊緣表面。在下頜下淋巴結(jié)的后面（這二種不要相混淆）。在《中國生物制品規(guī)程》2000年版中，規(guī)定的狂犬病疫苗的多項(xiàng)194.標(biāo)本的快速收集技術(shù)

在某些情況下可能難于或不可能尸解以便打開顱骨取腦,為減少這些困難已經(jīng)設(shè)計(jì)出簡便的技術(shù)，即用塑料管插入顱骨采集一小塊腦組織體。第一種技術(shù)是用吸管通過枕骨孔插入并往前推至一眼睛部位，則吸管中的腦組織內(nèi)含有部分腦干，小腦，海馬回和皮質(zhì)。第二種技術(shù)為將吸管通過眼窩后壁(用套管穿孔)并推至枕部，腦組織內(nèi)含有部分皮質(zhì)、海馬回、小腦。4.標(biāo)本的快速收集技術(shù)在某些情況下可能難于或20狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件211)材料

①取樣試管、塑料或玻璃吸管、套管。②保存或運(yùn)送溶液：80％甘油PBS。1)材料222)方法

(1)枕部途徑：①把動(dòng)物頸部往前彎曲，切開枕部和第一頸椎間的皮膚和肌肉；②割開寰椎一枕部韌帶，打開關(guān)節(jié)；③將取樣管通過枕孔插入并推向一只眼，拔出吸管，里面含有腦組織柱狀體。

(2)后眼框途徑：①將眼球推向一邊，用套管在眼窩后壁穿孔；②將取樣管插人推向顱骨后部對(duì)側(cè)拔出，吸管內(nèi)即含有腦組織柱狀體。

(3)腦柱體的收集：①用合適的棉拭子或用橡皮球從管于的清凈端吹氣將腦柱體從管子內(nèi)推在平皿內(nèi)；②如試驗(yàn)診斷需延期進(jìn)行則將腦柱體放進(jìn)裝有甘油溶液的螺旋蓋小瓶中。2)方法(1)枕部途徑：235.熒光抗體實(shí)驗(yàn)

FluorescentAntibodyTest(FAT)

該方法的特點(diǎn)是：——耗時(shí)短，整個(gè)FAT操作需30分鐘，若加上涂片、固定，則需2-4小時(shí)。——與小鼠顱內(nèi)接種試驗(yàn)MIT相比，符合率達(dá)99%?！锜晒怙@微鏡及高質(zhì)量的熒光標(biāo)記抗體。5.熒光抗體實(shí)驗(yàn)

FluorescentAntibod24狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件25狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件26狂犬病毒抗原熒光標(biāo)記抗狂犬病毒抗體免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測狂犬病毒抗原狂犬病毒抗原熒光標(biāo)記抗免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測狂犬病毒抗原27熒光抗體實(shí)驗(yàn)檢測狂犬病毒抗原

FAT的技術(shù)要求：——由于狂犬病毒多分布在動(dòng)物腦海馬回及腦干處，因此合適的取樣部位對(duì)抗原的檢測很重要?！X樣品印片必須用丙酮固定5-10分鐘，因?yàn)楸扇コ?xì)胞膜表面的脂類，以便抗體到達(dá)細(xì)胞內(nèi)與狂犬病毒結(jié)合。——腦樣品必須保存在含50%甘油的生理鹽水中，印片染色前需用生理鹽水洗滌數(shù)次。——熒光標(biāo)記抗體需最大限度降低非特異性反應(yīng)，因此制備特異性、高效價(jià)的抗體是FAT的關(guān)鍵。

熒光抗體實(shí)驗(yàn)檢測狂犬病毒抗原FAT的技術(shù)要28247.《保護(hù)用于科學(xué)和其它試驗(yàn)?zāi)康牡募棺祫?dòng)物公約》——ELISA法與MNT有較好的相關(guān)性，在小鼠飼養(yǎng)及組織培養(yǎng)不具備的實(shí)驗(yàn)室里，ELISA可視為MNT的替代方法。X/10=63/156.MNT和RFFIT檢測RV中和抗體含量的變異范圍：

MNT：67%~149%

RFFIT：68%~146%BSL-4：實(shí)驗(yàn)室成員應(yīng)在處理特別危險(xiǎn)的傳染源方面受過特殊和全面的訓(xùn)練，應(yīng)了解標(biāo)準(zhǔn)和特殊操作中一級(jí)和二級(jí)遏制的作用、遏制設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)性能。4天后觀察小鼠發(fā)病情況247.箱上應(yīng)清楚地標(biāo)明“小心，有感染性生物材料，狂犬病診斷用生物學(xué)標(biāo)本”字樣。五狂犬病毒核酸的檢測在選擇、運(yùn)送標(biāo)本前，實(shí)際操作獲得標(biāo)本的人員與實(shí)驗(yàn)室檢測人員事先取得聯(lián)系共同選擇實(shí)驗(yàn)方法是很重要的。247.取5μl未純化產(chǎn)物或1μl純化產(chǎn)物進(jìn)行1.——嚴(yán)格地講，ELISA實(shí)驗(yàn)并沒有測定真正的中和抗體，所測抗體為幾乎所有的與包被板上抗原結(jié)合的IgG抗體，包括一些非特異性抗體，所以其結(jié)果不用國際單位（IU/ml）表示，而是用等價(jià)單位（EU/ml）表示。第一種技術(shù)是用吸管通過枕骨孔插入并往前推至一眼睛部位，則吸管中的腦組織內(nèi)含有部分腦干，小腦，海馬回和皮質(zhì)。如參照國內(nèi)《規(guī)程》上的表述方式（不用對(duì)數(shù)），則上式可改寫為更直觀的形式：人狂犬病的生存期內(nèi)診斷BSL-3：實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)在處理致病性的和可能使人致死的病源方面受過專業(yè)訓(xùn)練，并由對(duì)該病源工作有經(jīng)驗(yàn)的、有資格的科學(xué)工作者監(jiān)督。在《歐洲藥典》2000年版中，相應(yīng)的檢定絕大多數(shù)均由細(xì)胞培養(yǎng)法所取代。廉價(jià)：一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔可取代一組小鼠，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用可顯著降低。——實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)的病毒(即固定毒)，當(dāng)接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或操作感染的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，特別是制備大量的高濃度病毒時(shí)，主要的傳染來源為手指被有感染的玻璃或工具刺傷或割破；2)特異性病毒包涵體在腦的一些部位更豐富，特別是海馬回，為了暴露海馬回，從一腦半球背面約半球間溝外側(cè)2cm處往下通過灰質(zhì)和白質(zhì)直到側(cè)腦室作一縱切。ＷＨＯ要求狂犬病病例的統(tǒng)計(jì)上報(bào)資料要注明診斷的依據(jù)（是否包括實(shí)驗(yàn)室診斷？）。雖然在臨床癥狀開始時(shí)，在皮膚活組織中可能檢出狂犬病抗原，但早期癥狀時(shí)僅有25-50%的患者為陽性，隨著病情的進(jìn)展陽性率也增加。(1)與其它狂犬病毒GP基因核苷酸序列同源性的比較各種抗原檢測方法的比較：1981年Anilionist等報(bào)道了狂犬病毒G基因序列，隨后幾年里，又對(duì)幾株狂犬病毒部分的或全部的基因進(jìn)行測定。廉價(jià)：一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔可取代一組小鼠，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用可顯著降低。人狂犬病的生存期內(nèi)診斷0

（GMT）15.——ELISA法與MNT有較好的相關(guān)性，在小鼠飼養(yǎng)及組織培養(yǎng)不具備的實(shí)驗(yàn)室里，ELISA可視為MNT的替代方法。OD值等于或大于CUTOFF的標(biāo)本均視為陽性。247.用N與PC為引物，采用AMVReverseTranscriptase(Promega)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。（狗腦）陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)（設(shè)已知國際單位的標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照）CVS病毒懸液（稀釋成30-100FFD50））經(jīng)與已知效力的疫苗標(biāo)準(zhǔn)品所作的對(duì)照進(jìn)行比較，即可推算出待測疫苗的效價(jià)。5IU/2ml=1.箱上應(yīng)清楚地標(biāo)明“小心，有感染性生物材料，狂犬病診斷用生物學(xué)標(biāo)本”字樣。我們用該方法檢測了我國廣西狗肉市場上出售的食用狗的腦組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在154份外觀健康的犬中，有5份為狂犬病毒抗原陽性，并且通過乳鼠顱內(nèi)接種，我們已分離到這5株狂犬病街毒株。熒光抗體實(shí)驗(yàn)檢測狂犬病毒抗原

操作要求：——印片不能太厚，否則易出現(xiàn)假陽性——一個(gè)切面最多可印4次，否則易出現(xiàn)假陰性——丙酮固定時(shí)間不宜太長——洗滌不宜過度——判讀結(jié)果應(yīng)快速，以免熒光淬滅229用抗狂犬病毒核蛋白的

單克隆抗體制備熒光結(jié)合物

我室目前采用抗狂犬病毒核蛋白的單克隆抗體制備熒光結(jié)合物，經(jīng)法國巴斯德研究所多次實(shí)驗(yàn)，分別檢測了人、犬、貓、狐貍、臭鼬、蝙蝠等動(dòng)物來源的樣品，證實(shí)我們的熒光抗體具有非特異性小、靈敏度高的特點(diǎn)，質(zhì)量上不比法國的產(chǎn)品差。我們用該方法檢測了我國廣西狗肉市場上出售的食用狗的腦組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在154份外觀健康的犬中，有5份為狂犬病毒抗原陽性，并且通過乳鼠顱內(nèi)接種，我們已分離到這5株狂犬病街毒株。用抗狂犬病毒核蛋白的

單克隆抗體制備熒光結(jié)合物我306.快速狂犬病酶免疫診斷法

RapidRabiesEnzymeImmunodetection(RREID抗狂犬病毒單抗狂犬病毒樣品酶標(biāo)抗狂犬病毒抗體6.快速狂犬病酶免疫診斷法

RapidRabies316.快速狂犬病酶免疫診斷法

技術(shù)特點(diǎn)：——本試劑盒操作方便、快速靈敏，適于大量樣本的檢測?！驹噭┖兄忻笜?biāo)板包被后需立即使用或保存于-20C備用?！庋塾^察：陽性對(duì)照顯黃顏色，陰性對(duì)照完全無色。所有顯黃色樣品，無論深淺均認(rèn)為是陽性。這種肉眼觀察已足夠作出診斷，非常經(jīng)濟(jì)，因?yàn)椴恍枰嘿F的酶標(biāo)儀，也最適合于作現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查?！笜?biāo)儀讀數(shù)：仔細(xì)擦凈平板底面，用450nm濾光片讀數(shù)。陽性對(duì)照光密度值（OD）必須大于1.0單位，陰性對(duì)照OD值須低于0.1單位，判定值（CUTOFF）的確定：陰性對(duì)照OD值

0.008。OD值等于或大于CUTOFF的標(biāo)本均視為陽性?！栺R林固定的樣品不適宜作RREID。6.快速狂犬病酶免疫診斷法技術(shù)特32狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件337.各種抗原檢測方法的比較：直接熒光抗體試驗(yàn)（FAT）:

最大優(yōu)點(diǎn)是快速、費(fèi)用低且敏感性和特異性高?？焖倏袢∶该庖咴\斷（RREID）試驗(yàn):

也是一種快速的診斷方法，有非常好的敏感性和特異性；與

FAT一樣，即使標(biāo)本的運(yùn)輸條件不太好，也不會(huì)過多影響結(jié)果。RREID也與腦標(biāo)本快速收集方法相適應(yīng)。細(xì)胞培養(yǎng)感染試驗(yàn)(RTCIT）:

成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)ＲＶ非常敏感和特異。能在24小時(shí)以內(nèi)得出結(jié)果，可替代小鼠分離病毒的方法。但此法只適合在裝備較好、工作人員受過較好訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。7.各種抗原檢測方法的比較：直接熒光抗體試驗(yàn)（FAT）:34

四狂犬病毒的分離和滴度測定

1.

小鼠顱內(nèi)接種分離狂犬病毒法（MIT）：

——該方法敏感，適于不具備組織培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)室分離狂犬病毒街毒?！臅r(shí)較長，僅憑動(dòng)物發(fā)病癥狀不足以確定為狂犬病毒，需配合免疫熒光法作特異性鑒定。四狂犬病毒的分離和滴度測定1.

小鼠顱內(nèi)接種分離狂35小鼠顱內(nèi)接種分離狂犬病毒法4-6只小白鼠(9-11g重)樣品，0.03ml/只4天后觀察小鼠發(fā)病情況小鼠顱內(nèi)接種分離狂犬病毒法4-6只小白鼠(9-11g重)36細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)

Cell-cultureIsolationTechniques(CIT)——該方法敏感，配合免疫熒光法可進(jìn)行特異性快速診斷?！柙诰邆浣M織培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)

Cell-cultureIsolatio37狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件38狂犬病毒抗原的檢測與診斷30%腦懸液樣品，5000rmp，30minN2a細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h后固定，加熒光標(biāo)記的抗狂犬病毒核蛋白抗體細(xì)胞無熒光，表明樣品中不含狂犬病毒細(xì)胞有熒光，表明樣品中含有狂犬病毒狂犬病毒抗原的檢測與診斷30%腦懸液樣品，5000rmp，39狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件40膠體金免疫層析法檢測狂犬病毒抗原

試紙有效性標(biāo)志狂犬病毒陽性標(biāo)志膠體金墊樣品插入端膠體金免疫層析法檢測狂犬病毒抗原

試紙有效性標(biāo)志狂犬413.組織培養(yǎng)狂犬病毒快速滴定法

待測RV樣品經(jīng)系列稀釋后，分別感染96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的BSR細(xì)胞。該細(xì)胞在感染RV后會(huì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成大量包涵體，其主要成分為RV的NP。感染24小時(shí)后，經(jīng)抗RVNP熒光標(biāo)記抗體特異性染色，可在熒光顯微鏡下觀察到熒光灶（FF,FluorescenceFocus）。通常在低倍顯微鏡(160X)下檢查8個(gè)視野。滴度用Reed&Muench方法計(jì)算，用熒光灶單位(FFU/ml)

3.組織培養(yǎng)狂犬病毒快速滴定法待測R42狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件43（設(shè)已知國際單位的標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照）CVS病毒懸液（稀釋成30-100FFD50））在“病毒對(duì)照”孔,加入100l培養(yǎng)基。（狗腦）陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)——耗時(shí)較長，僅憑動(dòng)物發(fā)病癥狀不足以確定為狂犬病毒，需配合免疫熒光法作特異性鑒定。(1)RT-PCR及測序引物P15’CTC-ATG-TGA-ACG-GGG-TGT3’為診斷的目的應(yīng)選基因組上的保守區(qū)。樣品的獲取可按下述方法進(jìn)行。（設(shè)已知國際單位的標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照）CVS病毒懸液（稀釋成30-100FFD50））2)只有4型不被PvuI切割(其余均為1個(gè)切點(diǎn))；在某些情況下可能難于或不可能尸解以便打開顱骨取腦,為減少這些困難已經(jīng)設(shè)計(jì)出簡便的技術(shù)，即用塑料管插入顱骨采集一小塊腦組織體。酶免疫吸附法（ELISA）：病毒最適攻擊量的確定：

24小時(shí)能使80%細(xì)胞被感染的最高稀釋度。n＝待測疫苗效力的最低合格要求（IU/ml）?！c小鼠顱內(nèi)接種試驗(yàn)MIT相比，符合率達(dá)99%。某參考品疫苗的效力N=2IU/ml，其ED50平均值是16倍稀釋，用常用對(duì)數(shù)表示為1.時(shí)間21天26小時(shí)4小時(shí)2小時(shí)為了確保實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的可信性，必需滿足若干條件：各血清學(xué)試驗(yàn)獲得結(jié)果所需時(shí)間如參照國內(nèi)《規(guī)程》上的表述方式（不用對(duì)數(shù)），則上式可改寫為更直觀的形式：(2)角膜涂片，用顯微鏡載玻片直接接觸角膜操作(不要用棉拭)，標(biāo)記玻片，空氣干燥并用鋁錫紙單片包裹。101.2)結(jié)果

我們將同一份CVS毒種分裝保存于一70℃，在半年時(shí)間內(nèi)重復(fù)測定6次，其滴度相當(dāng)穩(wěn)定（對(duì)于病毒稀釋度1：103.5，t=0.445，P>0.05；對(duì)于病毒稀釋度1：104.2，t=0.353，P>0.05）。此CVS毒種在小鼠中的毒力滴度為5.5LogLD50/ml(Sm=0.4LogLD50/ml),可用作毒力參考標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)未知RV樣品與此參考樣品在組織培養(yǎng)中用熒光灶單位(FFU/ml)表示的滴度的比值，可直接換算出其在小鼠中的LD50滴度。（設(shè)已知國際單位的標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照）CVS病毒懸液（稀釋成44狂犬病毒抗原檢測方法的比較診斷技術(shù)免疫熒光快速酶小鼠顱內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)膠體金實(shí)驗(yàn)免疫診斷接種分離技術(shù)免疫層析法所需時(shí)間2-3h3-4h5-10d20-24h5-10min特異性99.99%99.96%ND99.99%ND敏感性99.99%98.06%ND98.21%ND

狂犬病毒抗原檢測方法的比較診斷技術(shù)免疫熒光快速酶45狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件46狂犬病毒抗原的檢測與診斷多種方法對(duì)廣西狗肉市場狂犬病街毒檢測結(jié)果樣品例數(shù)MITRREIDIFAPCR（狗腦）陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)

1024*444*3份為狂躁型，1份為麻痹型狂犬病毒抗原的檢測與診斷多種方法對(duì)廣西狗肉市場狂犬病街毒檢測47五滅活疫苗效價(jià)的測定1.

改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(ABT)在體外快速檢測滅活狂犬病疫苗效力基本原理：

將定量的RV中和抗體與系列稀釋的滅活狂犬病疫苗在試管中進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，疫苗中的有效抗原成分會(huì)與相應(yīng)中和抗體結(jié)合，即消耗掉部分(或全部)中和抗體。然后將剩余的中和抗體用RFFIT方法在細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行快速測定。疫苗中的有效抗原成分含量越高，剩余的中和抗體的含量越低；經(jīng)與已知效力的疫苗標(biāo)準(zhǔn)品所作的對(duì)照進(jìn)行比較，即可推算出待測疫苗的效價(jià)。五滅活疫苗效價(jià)的測定1.

改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(ABT)在48改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(ABT)

在體外快速檢測滅活狂犬病疫苗效力

實(shí)例：我們對(duì)6批滅活狂犬病疫苗用ABT方法測定4次，并與用NIH試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行比較，兩種方法所得結(jié)果的差別均無顯著意義(t＝1.39,P>0.05)，即這兩種方法的結(jié)果基本相符。

ABT與NIH效力試驗(yàn)的結(jié)果有很好的相關(guān)性，而且更加快速、經(jīng)濟(jì)，重復(fù)性更好。該方法在大多數(shù)情況下可取代NIH效力試驗(yàn)。改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(ABT)

在體外快速檢測滅活狂犬病疫苗效力49改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(ABT)的應(yīng)用

改良ABT相對(duì)于NIH試驗(yàn)有許多明顯的優(yōu)點(diǎn),在德國等國已作為常規(guī)方法，在狂犬病疫苗的生產(chǎn)和科研中已普遍使用了約二十年，基本取代了NIH效力試驗(yàn)。此方法已載入WHO1996年版的《狂犬病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊》（第四版）。WHO推薦將此方法用于疫苗生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。不過在《歐洲藥典》2000年版中，此方法僅是推薦用于RV糖蛋白濃度檢測的方法之一。當(dāng)然RV糖蛋白濃度與疫苗的效力直接相關(guān)。改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(ABT)的應(yīng)用改良ABT相對(duì)502.簡化的NIH小鼠試驗(yàn)法

簡化的NIH小鼠試驗(yàn)法原則上與傳統(tǒng)的NIH法沒有區(qū)別。

此方法的核心:

將常規(guī)的測定三個(gè)稀釋度簡化為一個(gè)稀釋度，而且此稀釋度只用10只小鼠。

此方法的關(guān)鍵:

正確選定稀釋度。此稀釋度應(yīng)為假定該疫苗剛好達(dá)到2.5IU/劑的最低合格要求時(shí)的50％終點(diǎn)稀釋度(即ED50,

又稱50%有效劑量)。按此稀釋度接種10只小鼠，以有8只小鼠存活（得到保護(hù)）為合格標(biāo)準(zhǔn)。

2.簡化的NIH小鼠試驗(yàn)法簡化的NIH小鼠試驗(yàn)51稀釋度計(jì)算公式

此稀釋度可由以下公式計(jì)算決定：

D=Dm+log10(n)-log10(N)–log10(v)

其中，D＝待測疫苗的最小ED50（用常用對(duì)數(shù)表示）。

Dm＝參考品疫苗的平均ED50（用常用對(duì)數(shù)表示）。

n＝待測疫苗效力的最低合格要求（IU/ml）。

N＝參考品疫苗的效力（IU/ml）。

v=單劑待測疫苗的體積(ml)

國外文獻(xiàn)上通常采用上述公式。如參照國內(nèi)《規(guī)程》上的表述方式（不用對(duì)數(shù)），則上式可改寫為更直觀的形式：

D=(Dm×n)／(N×v)

稀釋度計(jì)算公式此稀釋度可由以下公式計(jì)算決定：52稀釋度計(jì)算舉例：

某參考品疫苗的效力N=2IU/ml，其ED50平均值是16倍稀釋，用常用對(duì)數(shù)表示為1.2，即Dm=1.2；單劑待測疫苗體積v=2ml,對(duì)其效力的最低合格要求是2.5IU/劑，因此n=2.5IU/2ml=1.25IU/ml。按公式計(jì)算：D=1.2+log10(1.25)-log10(2)–log10(2)=0.7100.7=5即ED50

為5倍稀釋。

如不用對(duì)數(shù)而直接計(jì)算，結(jié)果也相同：D=(16×1.25)／(2×2)=5。將待測疫苗按1:5稀釋接種10只小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如有8只以上的小鼠存活，則表明該待測疫苗的效力大于1.25IU/mlx2ml=2.5IU，即肯定該待測疫苗達(dá)到最低合格要求。稀釋度計(jì)算舉例：某參考品疫苗的效力N=53五狂犬病毒核酸的檢測

1．直接檢測法：用已知的互補(bǔ)于選定的基因區(qū)的一小段核酸序列作探針，進(jìn)行直接分子雜交檢測目的基因是否存在。

2．間接檢測法：在進(jìn)行分子雜交檢測目的基因是否存在以前，事先對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，再作分子雜交檢測。由于狂犬病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制產(chǎn)生的是RNA，所以擴(kuò)增的第一步必須將病毒的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，成為互補(bǔ)鏈DNA，然后再將該DNA用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。五狂犬病毒核酸的檢測1．直接檢測法：用已知的互補(bǔ)于54狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件551.基因擴(kuò)增(PCR)及檢測

PCR技術(shù)于1990年首次用于檢測狂犬病毒RNA，近幾年來狂犬病毒分子流行病學(xué)研究的進(jìn)展都與該技術(shù)的應(yīng)用有關(guān)。對(duì)原始樣品中的微量病毒RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄(RT)產(chǎn)生cDNA后，再經(jīng)PCR進(jìn)行放大。對(duì)放大產(chǎn)物可根據(jù)診斷或分型的不同需要分別用不同方法進(jìn)行分析，如凝膠電泳、斑點(diǎn)雜交、限制性片段長度分析(RFLP)、直接測序等。與傳統(tǒng)的病毒分離或免疫學(xué)檢測法相比，PCR在敏感性、特異性、特別是在能提供精確的序列資料等方面都要優(yōu)越得多，因此有希望更廣泛地用于狂犬病的常規(guī)檢測及分子流行病學(xué)研究。

1.基因擴(kuò)增(PCR)及檢測PCR技術(shù)于1956PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電流電泳圖譜PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電流電泳圖譜57狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件58狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件59RVPCR的目標(biāo)基因

在選擇RV基因組中的目標(biāo)基因時(shí)，為診斷的目的應(yīng)選基因組上的保守區(qū)。為分型及鑒別變異株應(yīng)選易變區(qū)。

N基因:高度保守且大量轉(zhuǎn)錄，適用于常規(guī)檢測，可檢出大樣品中含量很低的多種狂犬病毒。

L基因:其內(nèi)的若干區(qū)段也極穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)錄量較低，需采用特別敏感的檢測方法。

G和L基因間的間隔序列又稱偽基因:是進(jìn)化上某個(gè)蛋白編碼基因的殘跡。它最易發(fā)生突變，更能代表病毒的自然進(jìn)化，是最好的進(jìn)化“時(shí)鐘”。對(duì)偽基因的比較特別適用于區(qū)分親緣關(guān)系相近的毒株。

G蛋白:是誘生中和抗體的主要抗原且不如N蛋白穩(wěn)定。N蛋白雖不能誘生中和抗體，但與免疫保護(hù)反應(yīng)也有一定關(guān)系。為了解不同毒株的抗原特性和交叉保護(hù)的分子基礎(chǔ)，常需要對(duì)G基因和N基因進(jìn)行序列比較分析。RVPCR的目標(biāo)基因在選擇RV基因602.以基因擴(kuò)增對(duì)狂犬病毒進(jìn)行分型和來源鑒定以PCR為基礎(chǔ)的一種簡便實(shí)用的狂犬病毒分型方法是限制性片段長度多形性分析(RFLP)。例如，用3種限制性內(nèi)切酶即能方便地鑒別基因1、4、5和6型：一套引物可使樣品中N基因的PCR產(chǎn)物為長約1．5Kb的片段，對(duì)產(chǎn)物分別用3種限制酶消化：

1)只有PstI選擇性地切割6型(1個(gè)切點(diǎn))；

2)只有4型不被PvuI切割(其余均為1個(gè)切點(diǎn))；

3)DdeI可將1型切成2段，將5型切成多段。另一套覆蓋G-L的引物可經(jīng)PCR放大在狂犬病毒及相關(guān)病毒中最多變的偽基因，可用于對(duì)關(guān)系極近及極遠(yuǎn)的毒株定型。對(duì)放大產(chǎn)物用5種限制酶可區(qū)分6種主要疫苗株(PV、ERA、SADB9、HEP、CVS和PM株)，并可與當(dāng)前流行的野毒株作比較。若用免疫學(xué)方法，需用8種抗N和6種抗G單抗才能完成同樣的鑒別任務(wù)。2.以基因擴(kuò)增對(duì)狂犬病毒進(jìn)行分型和來源鑒定以PCR為基礎(chǔ)的61

狂犬病的潛伏期到底能有多長？

PCR技術(shù)應(yīng)用于狂犬病毒來源鑒定的

一個(gè)精彩例證：

美國CDC的Smith等對(duì)從美國3名狂犬病死者分離的毒株的鑒定。死者均為移民，其一移民時(shí)間已達(dá)6年。由于在美國感染狂犬病的機(jī)會(huì)極少，而且PCR／序列分析的結(jié)果直接證明分離株分別與死者來源國家的狗中流行的毒株相同，所以該作者以迄今最令人信服的方式證明了狂犬病的潛伏期可長達(dá)6年以上。狂犬病的潛伏期到底能有多長？

PCR技術(shù)應(yīng)用于狂犬病毒來源623.狂犬病毒G基因的序列測定和系統(tǒng)樹進(jìn)化分析

1981年Anilionist等報(bào)道了狂犬病毒G基因序列，隨后幾年里，又對(duì)幾株狂犬病毒部分的或全部的基因進(jìn)行測定。由此，通過序列分析，對(duì)各毒株之間的相互關(guān)系有了進(jìn)一步了解，明確了狂犬病毒分類的分子基礎(chǔ)。逐漸將狂犬病毒的核酸、氨基酸序列與已知的生物學(xué)和免疫學(xué)的特性聯(lián)系起來?？梢酝茰y或確定病毒的抗原決定簇，和病毒致病力有關(guān)的分子基礎(chǔ)，以及病毒感染、復(fù)制和變異等的重要功能性氨基酸區(qū)域。這對(duì)研制狂犬病毒新型疫苗和抑制狂犬病毒感染和復(fù)制有著重要的指導(dǎo)作用，從而更有利于對(duì)狂犬病毒的預(yù)防和和亞洲不同地區(qū)、不同來源的RV街毒株的Ｇ基因的全序列，確定決定其毒力、免疫原性和致病性的主要功能區(qū)，進(jìn)行了序列的系統(tǒng)進(jìn)化比較分析，探討我國及周連地區(qū)RV的遺傳變異規(guī)律。3.狂犬病毒G基因的序列測定和系統(tǒng)樹進(jìn)化分析163我所與法國巴斯德研究所

一項(xiàng)合作研究的實(shí)例：

(1)RT-PCR及測序引物

參考文獻(xiàn)和PV株序列，并用Oligo4.0軟件進(jìn)行校驗(yàn)，最后選取的引物為：N（55-73）5’ATG-TAA-CAC-CTC-TAC-AAT-GG3’PA(3000-3019)5’TGG-TGT-ATC-AAC-ATG-RAY-TC3’PB(4077-4096)5’ACC-CAT-GTY-CCR-TCC-ATA-AG3’PC(3894-3913)5’GAT-TAC-ACY-ATY-TGG-ATG-CC3’PD(5516-5536)5’GAG-TTN-AGR-TTG-TAR-TCA-GAG3’P15’CTC-ATG-TGA-ACG-GGG-TGT3’我所與法國巴斯德研究所

一項(xiàng)合作研究的實(shí)例：(1)64(2)病毒RNA的提取及RT-PCR

于四日齡乳鼠腦內(nèi)接種狂犬病病毒，注射量為0.02ml/只。待小鼠出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，取腦進(jìn)行熒光抗體檢測（IFA）。對(duì)陽性鼠腦，采用TRIzol?Reagent(GIBCOBRL)提取總RNA。用N與PC為引物，采用AMVReverseTranscriptase(Promega)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在0.5mlEp管中依次加入35.5μl滅菌水、1μldNTP、5μl10×Buffer、3μlMgCl2、1μlPA(1ulPC)、1μlPB(1ulPD)、1μlcDNA，短暫離心后100℃水浴1min，再加入0.5μlDNA聚合酶，50μl液體石蠟，短暫離心后置于PCR儀：經(jīng)94℃1min，58℃50s，72℃90s共循環(huán)40次，72℃保溫10min后冷卻至4℃。10000r/min離心5min后取下層水相轉(zhuǎn)入1.5mlEp管，取5μl用于電泳鑒定，余下的-20℃保存用于純化。(2)病毒RNA的提取及RT-PCR于四日齡65此方法已載入WHO1996年版的《狂犬病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊》（第四版）。改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(ABT)在體外快速檢測滅活狂犬病疫苗效力——ELISA法與MNT有較好的相關(guān)性，在小鼠飼養(yǎng)及組織培養(yǎng)不具備的實(shí)驗(yàn)室里，ELISA可視為MNT的替代方法。但是，角膜印片檢出率較低，陽性結(jié)果可肯定是狂犬病，而陰性結(jié)果并不能排除是狂犬病的可能。360.37℃中和1小時(shí)重復(fù)滴定LD50由此，通過序列分析，對(duì)各毒株之間的相互關(guān)系有了進(jìn)一步了解，明確了狂犬病毒分類的分子基礎(chǔ)。2)只有4型不被PvuI切割(其余均為1個(gè)切點(diǎn))；對(duì)放大產(chǎn)物可根據(jù)診斷或分型的不同需要分別用不同方法進(jìn)行分析，如凝膠電泳、斑點(diǎn)雜交、限制性片段長度分析(RFLP)、直接測序等。在選擇RV基因組中的目標(biāo)基因時(shí)，用N與PC為引物，采用AMVReverseTranscriptase(Promega)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在“病毒對(duì)照孔”,對(duì)病毒懸液進(jìn)行4次2倍稀釋,從1/2到1/16。（狗腦）陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)陽性數(shù)根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算中和指數(shù)及中和抗體含量9

15.5IU/劑，因此n=2.*3份為狂躁型，1份為麻痹型腦脊液及血清中的病毒中和抗體常常趨向于在病后7—10天出現(xiàn)。對(duì)偽基因的比較特別適用于區(qū)分親緣關(guān)系相近的毒株。247.將固定劑量的CVS病毒與系列稀釋的待測血清(包括已知滴度的參考血清)一起在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中溫育(體外中和反應(yīng))。(3)產(chǎn)物純化采用Wizaed?PCRPrepsDNAPurificationSystem(Promega)純化PCR產(chǎn)物。(4)電泳鑒定、cDNA序列測定取5μl未純化產(chǎn)物或1μl純化產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳。測序由大連寶生物有限公司完成。(5)序列分析序列的比較排序采用CLUSTER以及GENEDOC軟件處理。此方法已載入WHO1996年版的《狂犬病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊》（66聚類分析(進(jìn)化系統(tǒng)樹的構(gòu)建)聚類分析(進(jìn)化系統(tǒng)樹的構(gòu)建)672)結(jié)果和討論：

用計(jì)算機(jī)分析四株病毒糖蛋白基因（G基因）開放讀碼框架（ORF），四株病毒G基因編碼區(qū)均從起始密碼ATG開始，除終止密碼廣西-4株為TAA外均為TGA，從ATG到終止密碼全長共1575個(gè)核苷酸殘基。

(1)與其它狂犬病毒GP基因核苷酸序列同源性的比較

(2)狂犬病毒G基因不同區(qū)段比較

(3)疫苗的評(píng)價(jià)

(4)聚類分析(進(jìn)化系統(tǒng)樹的構(gòu)建)2)結(jié)果和討論：用計(jì)算機(jī)分析四株病毒糖蛋白基68五、狂犬病毒抗體的檢測

WHO狂犬病專家委員會(huì)認(rèn)為大于或等于0.5IU/ml的抗體水平表示能得到有效的保護(hù)。

1992年第八屆WHO狂犬病專家委員會(huì)肯定并推薦將小鼠中和試驗(yàn)(MNT)和RFFIT作為檢測RV中和抗體的兩項(xiàng)基本方法，這兩種方法應(yīng)作為其它方法的基準(zhǔn)和參考。

MNT是從上世紀(jì)30年代就開始采用的經(jīng)典方法。自上世紀(jì)70年代初開始，RFFIT逐漸成為國際上最廣泛接受的對(duì)MNT的替代方法。WHO專家委員會(huì)建議在可能時(shí)盡量用RFFIT代替MNT，因前者更快速、價(jià)廉，且靈敏度與MNT相同。五、狂犬病毒抗體的檢測WHO狂犬病專家委員會(huì)認(rèn)69小鼠中和試驗(yàn)

（Mouse

neutralizingtest,MNT）

原理：

將一定量預(yù)先滴定好的攻擊病毒，與待滴定的系列稀釋血清孵育。試驗(yàn)中需設(shè)已知滴度的參照血清。然后將病毒/血清混和物經(jīng)腦內(nèi)注射初成年小白鼠，計(jì)算死亡率和保護(hù)50%動(dòng)物的血清稀釋度。

特點(diǎn)：——可定量檢測狂犬病毒中和抗體效價(jià)?！鑼ｉT技術(shù)培訓(xùn)，操作較繁瑣?！?4天出結(jié)果，耗時(shí)長，不利于快速診斷?！栎^多試驗(yàn)小鼠，成本高?！?jiǎng)游镩g的個(gè)體差會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。小鼠中和試驗(yàn)

（Mouseneutralizingte70小鼠中和試驗(yàn)

三倍系列稀釋待測血清預(yù)先滴定過的中和用狂犬病毒（設(shè)已知國際單位的標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照）CVS鼠腦懸液（稀釋成30-300LD50））

等量混合37℃保溫1小時(shí)后

37℃中和1小時(shí)重復(fù)滴定LD50

顱內(nèi)接種10-12克小白鼠

觀察并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算中和指數(shù)及中和抗體含量小鼠中和試驗(yàn)三倍系列稀釋待測血清712.快速熒光灶抑制試驗(yàn)

（RFFIT）

RapidFluorescentFocusInhibitionTest基本實(shí)驗(yàn)過程：

將固定劑量的CVS病毒與系列稀釋的待測血清(包括已知滴度的參考血清)一起在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中溫育(體外中和反應(yīng))。病毒的最適劑量在預(yù)實(shí)驗(yàn)中預(yù)先確定，為經(jīng)24小時(shí)溫育后能使80%的細(xì)胞感染(產(chǎn)生熒光包含體)的最高稀釋度。中和反應(yīng)結(jié)束后在每孔中加入等量敏感細(xì)胞(BSR)懸液。再經(jīng)24小時(shí)溫育后,細(xì)胞單層用丙酮固定,用熒光標(biāo)記的抗NP抗體染色,以檢測未被中和的病毒的存在(熒光灶FFU)。與病毒對(duì)照組比較,計(jì)算每種待測血清使固定量CVS病毒的FFU/ml減少50%的稀釋度，然后與已知滴度的參考血清比較，計(jì)算每種待測血清的中和抗體滴度。2.快速熒光灶抑制試驗(yàn)（RFFIT）

RapidFl72快速熒光灶抑制試驗(yàn)三倍系列稀釋待測血清預(yù)先滴定過的中和用狂犬病毒（設(shè)已知國際單位的標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照）CVS病毒懸液（稀釋成30-100FFD50））

等量混合37℃保溫1小時(shí)后

37℃中和1小時(shí)復(fù)滴定TCID50

接種96孔已形成單層的BSR細(xì)胞

CO2孵箱37℃培養(yǎng)24小時(shí)

固定并用熒光抗體染色，熒光鏡觀察，記錄每孔熒光灶數(shù)量，計(jì)算血清抗體效價(jià)快速熒光灶抑制試驗(yàn)三倍系列稀釋待測血清73狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件74

病毒最適攻擊量的確定：

24小時(shí)能使80%細(xì)胞被感染的最高稀釋度。

病毒最適攻擊量的確定：

24小時(shí)能使80%細(xì)胞被感染的75MNT和RFFIT檢測RV中和抗體含量的變異范圍：

MNT：67%~149%

RFFIT：68%~146%

MNT和RFFIT檢測RV中和抗體含量的變異范圍：

76MNT和RFFIT

檢測2種抗RV血清參考品的結(jié)果

參考品RFFIT(IU/ml)MNT(IU/ml）

A13.414.0

20.219.5

12.713.9

15.518.0

（GMT）15.216.2

B40.552.2

70.042.2

52.360.0

66.247.3

（GMT）56.050.0MNT和RFFIT

檢測2種抗RV血清參考品的結(jié)果

參考品77微量RFFIT方法的建立

我所在八年前已開始建立起微量RFFIT方法，并對(duì)該方法的重復(fù)性、特異性和靈敏度與MNT進(jìn)行了比較，共檢測了數(shù)百份人畜血清樣品。該方法有希望在狂犬病的臨床診斷、疫苗質(zhì)量控制和流行病學(xué)調(diào)查等項(xiàng)工作中獲得廣泛應(yīng)用。微量RFFIT方法的建立我所在八年前已開始建立起78A.實(shí)驗(yàn)方法1)攻擊病毒的制備和滴定：

(1)通常采用的毒株為固定的狂犬病毒CVS株,在BHK/BSR細(xì)胞中制備。

(2)細(xì)胞上清分裝安瓶,儲(chǔ)存在-80℃。

(3)最適攻擊劑量為24小時(shí)溫育后能使80%的細(xì)胞感染(產(chǎn)生熒光包含體)的最高病毒稀釋度(預(yù)試驗(yàn)確定，參見前述組織培養(yǎng)狂犬病毒快速滴定法)。A.實(shí)驗(yàn)方法1)攻擊病毒的制備和滴定：792)血清病毒中和反應(yīng)：(1)待檢血清經(jīng)56℃30分鐘滅活。

(2)在96孔板上設(shè)置“未感染細(xì)胞對(duì)照”和“病毒對(duì)照”孔。

(3)每個(gè)血清稀釋度設(shè)2個(gè)孔。

(4)除病毒對(duì)照孔外,每個(gè)孔加入100

lD-MEM培養(yǎng)基。

(5)直接在孔中進(jìn)行待檢血清和參考血清的系列3倍稀釋:(每孔已加入100

l培養(yǎng)基)將50

l血清加入第一排孔,依次從1/3到1/81稀釋。在“病毒對(duì)照”孔,加入100

l培養(yǎng)基。

(6)在含稀釋血清的每個(gè)孔內(nèi),加入50

l預(yù)先滴定的病毒懸液。在“未感染細(xì)胞對(duì)照”孔內(nèi),加入50

l培養(yǎng)基。在“病毒對(duì)照孔”,對(duì)病毒懸液進(jìn)行4次2倍稀釋,從1/2到1/16。

(7)在37℃5%恒濕溫箱中保溫1小時(shí)。2)血清病毒中和反應(yīng)：(1)待檢血清經(jīng)56℃803)加入細(xì)胞：(1)用胰酶消化細(xì)胞,制備濃度為1x106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液.每孔加入50

l細(xì)胞懸液(5x104

細(xì)胞)。

(2)在37℃5%CO2

恒濕溫箱中溫育24小時(shí)。3)加入細(xì)胞：(1)用胰酶消化細(xì)胞,制備濃度為181

4)固定和染色：

(1)用與盛有漂白粉溶液的大瓶相連的真空裝置抽吸去各孔中的上清液。

(2)用PBS浸泡各孔3次,每次5分鐘(抽吸上清液)。

(3)以80%丙酮浸洗各孔,重復(fù)一次(在-20’C放置5分鐘)。抽干各孔,空氣干燥。

(4)每孔加入40

l抗NP抗體熒光結(jié)合物(預(yù)先1:20)稀釋),在37’C濕盒中保溫30

分鐘。

(5)吸出結(jié)合物,以PBS洗2次，第一次1分鐘,第二次5分鐘。

(6)空氣干燥,每孔加1滴甘油。

(7)螢光顯微鏡下觀察。4)固定和染色：82

B.結(jié)果觀察

1)記錄每孔的螢光數(shù)(FF)。

2)與病毒對(duì)照組比較,對(duì)每種待測血清計(jì)算FF數(shù)減少50%的稀釋度。

3)與參考血清比較,計(jì)算每種待測血清的滴度。B.結(jié)果觀察1)記錄每孔的螢光數(shù)(FF)。83

C.計(jì)算實(shí)例:

血清X1/27:15%參考血清:10IU/ml1/81:20%1/81:60%1/243:70%

(50-15)/(60-15)xLog3+Log27(50-20)/(70-20)xLog3+Log81=0.371+1.4314=1.80=0.286+1.9=2.194101.8=63102.194=156.5X/10=63/156.5X=4.03IU/mlC.計(jì)算實(shí)例:血清X1/27:15%84用MNT和RFFIT測定2種抗RV中和血清參考品的結(jié)果

參考品RFFIT(IU/ml)MNT(IU/ml）

A13.414.0

20.219.5

12.713.9

15.518.0

（GMT）15.216.2

B40.552.2

70.042.2

52.360.0

66.247.3

（GMT）56.050.0用MNT和RFFIT測定2種抗RV中和血清參考品的結(jié)果85RFFIT的特點(diǎn)：——可定量檢測狂犬病毒中和抗體效價(jià)?！臅r(shí)較短，可用于精確定量的快速診斷?！貜?fù)性好?！鑼ｉT技術(shù)培訓(xùn)，操作較繁瑣。——需熒光顯微鏡。RFFIT的特點(diǎn)：863.酶免疫吸附法（ELISA）：

酶免疫吸附法是七十年代建立的方法，目前世界上用于檢測狂犬病毒抗體的酶免疫法基本上是采用間接ELISA法，其吸附抗原有全病毒顆粒、純化的狂犬病毒糖蛋白以及純化的狂犬病毒核衣殼蛋白（RNP），并以過氧化物酶標(biāo)記的抗抗體作為標(biāo)記抗體，即可檢測人及不同動(dòng)物血清中的抗狂犬病毒抗體。3.酶免疫吸附法（ELISA）：酶免疫吸附法87各種檢測狂犬病毒抗體的ELISA法的抗原抗體比較酶免疫吸附法吸附抗原所檢測的抗體間接ELISA純化狂犬病毒糖蛋白抗狂犬病毒糖蛋白抗體（中和抗體）間接ELISA純化全病毒顆?？箍袢《究贵w（含中和抗體）間接ELISA粗制狂犬病毒抗吸附抗原的抗體（含中和抗體）間接ELISA純化狂犬病毒核衣殼蛋白抗狂犬病毒核衣殼蛋白夾心間接ELISA狂犬病毒抗原抗狂犬病毒抗原抗體（含中和抗體）

各種檢測狂犬病毒抗體的ELISA法的抗原抗體比較酶免疫吸附法88酶免疫吸附法

抗狂犬病毒單抗包被

狂犬病毒抗原待檢人血清中的抗狂犬病毒抗體酶標(biāo)抗人IgG抗體顯色底物酶免疫吸附法抗狂犬病毒單抗包被狂犬病毒抗原待檢人血清中89ELISA的特點(diǎn)：——ELISA只需簡單的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，尤其適合檢測大量的血清樣品，且在很短的時(shí)間內(nèi)即可出結(jié)果?！狤LISA法與MNT有較好的相關(guān)性，在小鼠飼養(yǎng)及組織培養(yǎng)不具備的實(shí)驗(yàn)室里，ELISA可視為MNT的替代方法?！獓?yán)格地講，ELISA實(shí)驗(yàn)并沒有測定真正的中和抗體，所測抗體為幾乎所有的與包被板上抗原結(jié)合的IgG抗體，包括一些非特異性抗體，所以其結(jié)果不用國際單位（IU/ml）表示，而是用等價(jià)單位（EU/ml）表示。ELISA的特點(diǎn)：——ELISA只需簡單的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，尤其適90狂犬病的試驗(yàn)室檢測與診斷技術(shù)課件91

EIA與MNA檢測狂犬病毒抗體結(jié)果比較

免疫用疫苗例數(shù)MNAEIAEIA

陽性數(shù)陽性數(shù)陽檢率

維爾博苗747474100%

aG濃縮苗67676292.5%

CTN精制苗34/31/

EIA與MNA檢測狂犬病毒抗體結(jié)果比較

免疫用疫苗924.其他檢測抗體的方法：

1）斑點(diǎn)免疫結(jié)合法（DIA）：

1986年由Heberling等建立，用于檢測人血清中狂犬病毒抗體，其結(jié)果與RFFIT具有可比性，但須稍作改進(jìn)以檢測狂犬病毒中和抗體水平。該方法只需一滴血、僅30-40分鐘即可出結(jié)果。4.其他檢測抗體的方法：1）斑點(diǎn)免疫結(jié)合法（DIA）：932）快速凝集法（RAT）：

以抗原致敏乳膠，可檢測2.5IU/ml以上的抗體水平,RAT與MNT符合率達(dá)97%以上。2）快速凝集法