目的基因的重組導(dǎo)入課件

第五章目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第五章目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1外源目的基因與載體在體外連接重組后形成重組DNA分子，該重組DNA分子必須導(dǎo)入適宜的受體細(xì)胞中方能使外源目的基因得以大量擴(kuò)增或表達(dá)。外源目的基因與載體在體外連接重組后形成重組DNA分子，該重2外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞基因的重組與轉(zhuǎn)移

外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表3目的基因的重組導(dǎo)入ppt課件4DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)：插入片段與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進(jìn)行非互補(bǔ)粘性末端連接。第一節(jié)、DNA片段的體外連接DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)：插入片段與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同5EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3A、XhoII都產(chǎn)生GATC4個(gè)堿基的粘性末端。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾62.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI2.DNA插入的方向正確（1）用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不7當(dāng)外源DNA以非定向的方式插入克隆載體時(shí)，需用測(cè)序或酶切的方法確定插入方向，上述兩種方法或昂貴或費(fèi)力。一種快速、簡便的PCR法，即利用載體的通用引物和目的片段的兩個(gè)特異性引物直接擴(kuò)增重組菌落，從而達(dá)到鑒別DNA插入方向的目的。

當(dāng)外源DNA以非定向的方式插入克隆載體時(shí)，需用測(cè)序或酶切的方83.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定位插入載體（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片段EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定位插入94.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片段的用量（2）用堿性磷酸酶處理載體5’

3’

載體插入片段4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片段的用量（2）用堿10載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果11受體細(xì)胞：

原核生物細(xì)胞真核生物細(xì)胞酵母菌細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞受體細(xì)胞：12第二節(jié)、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌第二節(jié)、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌13大腸桿菌受體細(xì)胞的選擇

1、重組缺陷型：避免與受體基因組進(jìn)行同源重組，便于重組DNA獨(dú)立存在2、限制缺陷型:避免修飾和降解，使重組DNA穩(wěn)定存在易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)：提高細(xì)胞的通透性，較高的轉(zhuǎn)化率4、遺傳互補(bǔ)型：有明顯的選擇性差異，有利于重組體篩選具有較好的翻譯后加工，有利于真核基因表達(dá)6、感染缺陷型：防止感染，安全性高，無致病基因大腸桿菌受體細(xì)胞的選擇1、重組缺陷型：避免與受體基因組進(jìn)行14使用喪失了限制修飾體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。1.菌種，大腸桿菌，枯草桿菌，藍(lán)細(xì)菌使用喪失了限制修飾體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。115目的基因的重組導(dǎo)入ppt課件162.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（1）轉(zhuǎn)化（transformation)通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。2.外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（1）轉(zhuǎn)化（transfo17（2）轉(zhuǎn)染（transfection)噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的DNA重組體直接導(dǎo)入受體細(xì)胞而獲得新的遺傳表型。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)噬菌體、病毒或以它們?yōu)?8當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（受體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（受體19用CaCl2處理大腸桿菌，細(xì)菌表面正電荷增加，細(xì)胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子的吸附和吸收能增加膜的通透性。3、感受態(tài)大腸桿菌的制備用CaCl2處理大腸桿菌，細(xì)菌表面正電荷增加，細(xì)胞壁和膜的通20

當(dāng)細(xì)菌處于0℃、二價(jià)陽離子（如Ca2+、Mg2+等）低滲溶液中時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形，處于感受態(tài)；此時(shí)轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，重組DNA在42℃短時(shí)間熱沖擊后吸附在細(xì)胞表面而利于進(jìn)入，在豐富培養(yǎng)基中生長數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞恢復(fù)原狀并繁殖。

制備原理當(dāng)細(xì)菌處于0℃、二價(jià)陽離子（如Ca2+、Mg2+等）低滲21

制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice223.重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體的轉(zhuǎn)化方法

大腸桿菌在0℃CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－磷酸鈣復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/

gDNA）。（1）熱激法或熱休克轉(zhuǎn)化法(Heatshocktransformation)

3.重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體的轉(zhuǎn)化方法大腸桿菌在0℃CaC2310ng載體DNA100

L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1.5分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時(shí)10-100

L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置24（2）電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率高（高于109/

gDNA）。在高壓脈沖下，外加于細(xì)胞膜上的電場造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，也有利于DNA等大分子進(jìn)入。脈沖過后，微孔復(fù)原，在豐富培養(yǎng)基中生長數(shù)小時(shí)后，細(xì)胞增殖，重組DNA得到大量復(fù)制。

（2）電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。在高壓脈25目的基因的重組導(dǎo)入ppt課件26LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300

L

電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25

F

脈沖控制器200-400

0.5

g質(zhì)粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘10-100

L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°27（3）平板培養(yǎng)細(xì)菌10-100

L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜（3）平板培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板28環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片段進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒

4.轉(zhuǎn)化率和影響轉(zhuǎn)化率的因素每

gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)總受體細(xì)胞所獲的轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌數(shù)環(huán)形重組質(zhì)粒線性載體或DNA片段進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。①環(huán)形質(zhì)29①生長狀態(tài)對(duì)數(shù)生長期的菌②4℃④儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理要充分⑤使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化（2）感受態(tài)細(xì)胞

（competentcells)①生長狀態(tài)對(duì)數(shù)生長期的菌②4℃④儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70℃以30轉(zhuǎn)化率高的菌株；有突變的菌株（互補(bǔ)）；不育的菌株（不會(huì)接合）一、酵母細(xì)胞1.菌株選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his3

1三、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化率高的菌株；一、酵母細(xì)胞1.菌株選擇如：ura3-531（1）利用原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化2.酵母的轉(zhuǎn)化方法

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)蝸牛消化酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的重組載體轉(zhuǎn)化（1）利用原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化2.酵母的轉(zhuǎn)化方法酵母原生質(zhì)32

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的重組載體感受態(tài)40%PEG4000（2）利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的重組載體感33消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、植物細(xì)胞1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、植物細(xì)胞34植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25

F電擊愈傷組織幼苗分化2.電擊法（electroporation)植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-235又稱高速微型子彈射擊法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2

m鎢彈頭吸附基因槍射擊植物裝入3.基因槍法（genegun）又稱高速微型子彈射擊法（High-velocitymicr36（1）原理：三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞1.磷酸鈣沉淀法HEPES緩沖鹽水與含有氯化鈣和DNA的溶液緩慢混合，會(huì)形成含磷酸鈣和DNA的沉淀，倒入培養(yǎng)細(xì)胞平皿，DNA和磷酸鈣形成共沉淀物，黏附到培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物單層細(xì)胞表面，就可被細(xì)胞捕獲。依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有10%的細(xì)胞能吸收DNA沉淀。（1）原理：三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞1.磷酸鈣沉淀法HEPES緩沖37不需要載體。（2）特點(diǎn)：不需要載體。（2）特點(diǎn)：38脂質(zhì)體(liposomes)是一種人造磷酸雙分子膜。包裝成脂質(zhì)體的SV40DNA的感染性，至少要比其裸露DNA高出100倍，用它包裝的DNA在4℃可長期保存不失活性，可保護(hù)DNA免受核酸酶的降解作用。以脂質(zhì)體為載體的基因轉(zhuǎn)移通常是先用PEG處理培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞，使之易于吸收脂質(zhì)體。正常情況下，每個(gè)細(xì)胞平均可吸收1000個(gè)左右。2.脂質(zhì)體（lipofectin）載體法脂質(zhì)體(liposomes)是一種人造磷酸雙分子膜。包39目的基因的重組導(dǎo)入ppt課件40脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如LifeTechnologies）。脂質(zhì)體包埋DNA，通過與細(xì)胞膜融合進(jìn)入細(xì)胞脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如LifeTechnologies）。41直接把外源DNA注射到宿主雄細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。3.顯微注射法(microinjection)直接把外源DNA注射到宿主雄細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。342

二乙胺乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran,DEAE-dextran)是一種高分子多聚陽離子試劑，能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞捕獲外源DNA。其機(jī)理可能是因?yàn)槠暇厶桥cDNA形成復(fù)合物而抑制了核酸酶對(duì)DNA的作用，也可能葡聚糖與細(xì)胞結(jié)合而引發(fā)了細(xì)胞的內(nèi)吞作用。DEAE-dextran轉(zhuǎn)染主要有2種不同的方法。一種是受體細(xì)胞先用DEAE-dextran溶液預(yù)處理，然后再與轉(zhuǎn)染的DNA接觸；另一種是先使DNA直接同DEAE-dextran混合，形成DNA/DEAE-dextran復(fù)合物后，再用來處理細(xì)胞。

4.DEAE---葡聚糖轉(zhuǎn)染法二乙胺乙基葡聚糖(diethyl-aminoeth43細(xì)胞外源DNA預(yù)處理攝入DEAE外源DNA細(xì)胞混合D