transwell不得不注意的幾點

這里想明確兩個概念，一個是Transwell，另一個是腫瘤細胞侵襲模型。1．Transwell關于Transwell這個詞該如何解釋，查了很多資料也未見準確的注解，我覺得可以這么理解吧，trans-這個詞根有轉移、轉運、穿過等意思，well有小室的意思，可以從字面上理解，這是一類有通透性的杯狀的裝置，根據(jù)Corning公司的Transwell說明書中的介紹，可以認為這是一種膜濾器(Membranefilters)，也可認為是一種有通透性的支架(permeablesupports)。更準確地說，Transwell應該是一種實驗技術，這項技術的主要材料是Transwell小室(Transwellchamber，Transwellinsert)，其外形為一個可放置在孔板里的小杯子，不同廠家對Transwell會有不同的命名，而不同型號也可有不同形狀，不同大小，根據(jù)實驗需要，可有不同選擇。但無論是何種外形，其關鍵部分都是一致的，那就是杯子底層的一張有通透性的膜，而杯子其余部分的材料與普通的孔板是一樣。這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.1—12.0pm，根據(jù)不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonatemembrane)。將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內稱上室，培養(yǎng)板內稱下室，上室內盛裝上層培養(yǎng)液，下室內盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。應用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。下面參考guxuefeng戰(zhàn)友和cosmosci戰(zhàn)友的帖子具體來談談孔徑的選擇，當然不同細胞其體積不同，具體選擇時要考慮到細胞大小。這里主要談幾種大家常用的實驗：.共培養(yǎng)體系：小于3.0um孔徑條件下，細胞不會遷徙通過，因此，若研究不涉及細胞運動能力，不需要細胞穿過聚碳酸酯膜，則應選擇3.0pm以下孔徑。常用0.4、3.0pm。我們實驗室用的是0.4pm。將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可以研究細胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質對細胞A的影響。.趨化性實驗可用5.0、&0、12.0pm膜，上室細胞可穿過聚碳酸酯膜進入下室，計數(shù)進入下室的細胞量可反映下室成分對上室細胞的趨化能力。細胞B對細胞A的趨化作用：將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可以研究細胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質對細胞A的趨化作用。趨化因子對細胞的趨化作用：將細胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對細胞的趨化作用。(3).腫瘤細胞遷移實驗常用&0、12.0pm膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。(4).腫瘤細胞侵襲實驗常用&0、12.0pm膜，原理與腫瘤細胞遷移實驗類似。上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，但與腫瘤細胞遷移實驗不同的是，聚碳酸酯膜上室側鋪上一層基質膠，用以模仿體內細胞外基質，細胞欲進入下室，先要分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)將基質膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。以上是Transwell的一些常見的應用2．步驟2．1Transwell小室制備2.1.1無基質膠Transwell小室制備包被基底膜：用50mg/LMatrigel1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4°C風干。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉，吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原(collagen)的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37C,30min。另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel(3.9ug/ul)60-80pl(注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37C30min使Matrigel聚合成凝膠。2.1.2有基質膠的Transwell小室制備Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300pl預溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15-30min，使基質膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。2.2制備細胞懸液制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12-24h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1—2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調整細胞密度至1—10x105，個人認為不要超過5x105。具體實驗時采用密度要自己摸索，因為不同細胞，其侵襲能力是不同的。個人經(jīng)驗，細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，如果最后用計數(shù)法統(tǒng)計結果的話將難以計數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測的時間點，所有的細胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時候，上室內還要有一定量的細胞存在。個人認為，對照組和處理盡量不要分開計數(shù)，因為細胞數(shù)目的差異會嚴重影響實驗結果。如果需要對細胞預處理而不得不分開計數(shù)，那么計數(shù)一定要多重復幾次，力求準確，盡量保證對照組和處理組細胞密度一致。2．3接種細胞取細胞懸液100—200卩1加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對細胞懸液量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200卩l(xiāng)。24孔板下室一般加入500pl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)12—48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數(shù)目的影響也不可忽視。以我的課題為例，我使用的藥物不僅會抑制腫瘤細胞侵襲力，還對細胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物濃度是用MTT篩選出的72h的IC50。用這個濃度處理細胞，24h內對細胞增殖并無明顯抑制，但24h后，抑制作用就開始出現(xiàn)了。所以，用這個濃度來做Transwell,處理時間也必須限定在24h內，否則一旦藥物抑制了細胞增殖或者誘導出凋亡，使處理組細胞數(shù)目少于對照組，那么就難以肯定穿過膜的細胞比對照組少，究竟是由于侵襲被抑制引起，還是處理后細胞數(shù)目本身就比對照組少而引起的了。時間過長不可以，同樣，過短也不行，因為細胞內會有一定量的MMPs儲存，短時間內可能侵襲能力不會有太大改變。同時從藥物被吸收進去，進而發(fā)揮作用，影響MMPs表達，到最后釋放到培養(yǎng)基中，還需要一個過程。時間點的選擇可盡量長點，也可選擇多個時間點研究時間依賴效應，但前提是這個時間范圍內細胞數(shù)目不能有明顯變化。另外，我看到細胞在小室內的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時的形態(tài)，不過會聚集成團，所以看到細胞不正常貼壁也不要緊張，是正?，F(xiàn)象在培養(yǎng)過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正?，F(xiàn)象，可不予處理，但我遇到過培養(yǎng)一段時間后，膜下出現(xiàn)了大氣泡，幸虧及時發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常嚴重。因此，個人建議，最好接種細胞后1—2h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產(chǎn)生。2．4結果統(tǒng)計檢測穿過的細胞數(shù)有兩種方法：2．4．1直接計數(shù)法2．4．1．1“貼壁”細胞計數(shù)這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去。通過給細胞染色，可在鏡下計數(shù)細胞①用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞染色：常用的染色方法有結晶紫染色、臺肦藍染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。個人推薦采用0.1%結晶紫染色，這種方法有如下優(yōu)勢：(1).不需要固定細胞，直接染色即可。(2).配制簡單方便。(3).染色后可以用33%醋酸脫色，將結晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570nm測其OD值，間接反映細胞數(shù)。個人認為這是結晶紫染色最大的優(yōu)勢所在。因為，雖然經(jīng)過準確的細胞計數(shù)，往往穿過膜的細胞數(shù)仍難以準確控制，可能某一批實驗穿過的細胞會特別多，以致細胞成堆，這種情況下就難以計數(shù)了，這種情況下就可以用醋酸脫色后用酶標儀檢測。使用結晶紫染色要注意，染色前要將膜風干，否則可能會染不上。細胞計數(shù)：我們使用的是LeicaDC300F正置顯微鏡進行觀察和拍照，把Transwell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側附著的細胞。也有不少人用手術刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點浪費。取若干個視野計數(shù)細胞個數(shù)。論壇里一般采用3－5個視野，也有人用10個，都是隨機選取，個人認為這樣選擇的視野帶有很大的偶然性，也會摻進人為影響，特別是計數(shù)視野較少的時候。我選取16個視野，不是隨機選擇，而是有固定的位置。我們使用的顯微鏡所看到的視野的直徑剛好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直徑的1/4。不同廠家不同型號的小室，膜的面積不盡相同，但個人認為，拍照時還是應當選取固定的位置，并選擇盡可能多的視野。2．4．1．2“非貼壁”細胞計數(shù)由于某些細胞自身的原因或某些膜的關系，有時細胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進下室。這種情況我沒有遇到過，根據(jù)論壇里提供的經(jīng)驗，可以收集下層培養(yǎng)液，用流式細胞儀計數(shù)細胞量，也可用細胞計數(shù)的方法直接在鏡下計數(shù)，個人認為MTT應該也是可以用的，有興趣的可以試試看。2．4．1間接計數(shù)法間接計數(shù)法主要用于穿過細胞過多，而無法通過計數(shù)獲得準確的細胞數(shù)所采用的方法，與常用的MTT實驗是同樣的原理。2．4．1．1MTT法用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞24孔板中加入500卩1含0.5mg/mlMTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37°C4h后取出。24孔板中加入500卩1DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶標儀上測OD值。2.4.1.1熒光試劑檢測這類方法一般是與Transwell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染料染細胞，再將細胞裂解，檢測熒光值。Chemicon的ECM554即屬于這類。2.4.1.1結晶紫檢測上文已說過，這里不再贅述，原理與MTT法也是類似的。但結晶紫染色還有個優(yōu)點，就是染色和脫色的過程并不影響膜上細胞，在脫色后還可重新染色。我的課題涉及Transwell侵襲實驗和Transwell遷移實驗，其他方面的Transwell應用我不太清楚，因此這里主要談談Transwell侵襲實驗。1．實驗用品：①Transwell小室：多種廠家可提供，論壇里常用的是Costar、Corning、BD生產(chǎn)的小室，我們實驗室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boydenchamber、Millipore公司的millicell和雕弓滿月射天狼戰(zhàn)友介紹的Thincert。這些廠家提供的小室，有的已鋪好基質膠，買來就可以用，很方便，但也比較貴，我們實驗室用的Chemicon公司的ECM550系列是已經(jīng)鋪好膠的，質量很好，但是非常貴，24孑L板配套的小室，每個價格約130元，不推薦給大家。BD也有已包被好的，價格不清楚。Coster和Corning公司生產(chǎn)的小室，是論壇里比較常用的，好像是要自己鋪膠，但據(jù)說每個小室成本只有40左右，應該比較適合中國國情。下面是一些戰(zhàn)友提供的價格，具體建議大家聯(lián)系代理商咨詢。linanping1979戰(zhàn)友提供的價格：coster的24孑L板的transwell的價格是456元RMB,8pm，用于腫瘤的侵襲實驗。iceyxy戰(zhàn)友提供的價格：Millipore的8pm的50個1760RMB,0.4pm的2000多，是一次性的。梅林戰(zhàn)友提供的BD價格：240RMB—塊(6.5um,24孔,12instert),好像是沒膠的。liguofan說國產(chǎn)的boyden30塊一個。jjyy提供的價格是：corningcatNo.3422.6.5mmtranswellwith8.0umprorepolycarbonatemembraneinsert,Qty48,950人民幣不到。平均每個20元不到。Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不過其實洗洗泡泡還是可以重復用的。我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基質膠，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干凈，用前用紫外里外都照30min。sword01戰(zhàn)友提供的處理方法：用棉簽輕輕擦去膠和反面細胞，清水沖洗，超聲清洗，低擋，30min,清水3x5min,蒸餾水3x5min，室溫涼干，用前紫外線小室正面3h，反面6h,微波，低火10minx2。因為我買的是鋪好膠的，所以沒買Matrigel，二次利用的小室只用來做不需要鋪膠的遷移實驗。以前的ChemiconECM550系列，膜很結實，擦不壞，可以反復用很多次，但現(xiàn)在的膜已經(jīng)改用一種很薄很脆的材料，一般只能重復用一次，真黑?。『芏鄳?zhàn)友說Costar和Corning也是可以重復用的，大家可以試試。本人沒見過，有興趣的可以自己研究一下。另外，根據(jù)論壇戰(zhàn)友提供的信息,osmonic公司有專用的膜出售，鼎國生物代理。Transwell小室用過后，可把原來的膜切下，貼上osmonic公司的膜，這樣又可以用了，不過我沒用過，有興趣的可以試試。maojianwen戰(zhàn)友的使用方法：trasnwell小室做一次后，將原來的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用無色較稀的）將osmonic公司的膜貼上，剪掉多余的邊緣。再照紫外。②上層培養(yǎng)液：上層培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2%BSA。③細胞：值得注意的是，有侵襲能力的細胞才可用于Transwel1侵襲實驗。建議實驗前先用酶譜法檢測MMPs的表達，特別是MMP-2的表達。如果不清楚細胞MMPs的表達情況，就盲目進行Transwell侵襲實驗，可能會造成不必要的浪費，一次Transwell侵襲實驗花錢少則數(shù)百，多則數(shù)千，并不是筆小數(shù)目，還是小心為妙。另外，為了讓實驗結果更明顯，可先撤血清讓細胞饑餓12-24h，再進行實驗。基質膠：常用的是人工重構基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和IV型膠原，生產(chǎn)廠家有BD、美國CollaborativeRsearch公司等。CaoY戰(zhàn)友的帖這么說的：Matrigel是BD公司生產(chǎn)的，是一種細胞外基質，4度時是液體，在37度會逐漸凝固成膠狀，不可逆。同樣的東西在sigma叫ECM。zhangyongl036戰(zhàn)友提供的價格：BD公司的matrigel1500左右。如果購買的小室是已經(jīng)鋪好基質膠的，那么Matrigel就不需要購買了。下層培養(yǎng)液：下層常用含5%-10%FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細胞侵襲力而定，侵襲力弱的細胞可適當提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化因子，但個人認為，F(xiàn)BS仍是最合適的。細胞培養(yǎng)板:常用于Transwell侵襲實驗的細胞培養(yǎng)板有6孑L板、12孑L板、24孔板等，以24孔最常用。細胞培養(yǎng)板沒什么特殊要求，普通的細胞培養(yǎng)板就可以。但要注意，細胞培養(yǎng)板應當與購買的Transwell小室相配套。此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白（fibronectin,FN,Sigma有售），這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。很多戰(zhàn)友認為這不是必須的，而且我也是不涂的，細胞照樣貼壁很好。如果貼壁不好的話可以試試看。linanping1979戰(zhàn)友認為，如果培養(yǎng)時間很長（＞24h），細胞還是會掉到下室里面去，所以有條件的話，最好還是在膜下層涂上FN。另外，值得一提的是，膜下層涂上FN還有一定的趨化作用。zhangyong1036戰(zhàn)友提供的價格：sigma的fibronectin，價格在1500左右。1．Transwell腫瘤細胞遷移實驗過程與Transwell侵襲實驗基本一致，不同的只是不需要鋪Matrigel。個人認為，由于沒有基質膠的阻擋，細胞穿過膜的速度較侵襲實驗明顯加快，所以細胞量要更大。我做侵襲實驗的細胞密度是1x105，而遷移實驗的密度是1x106。另外，下層培養(yǎng)液的FBS濃度也可適當下調，我做侵襲實驗的濃度是5%，遷移實驗的濃度是2.5%。2?Transwell上皮細胞培養(yǎng)步驟做了一段時間的原代細胞培養(yǎng)，把經(jīng)驗拿出來跟大家分享一下吧，請有關戰(zhàn)友共同探討：.將雄性wistar大鼠麻醉，開胸，將氣管取出，置于4°C含0.1%胰蛋白酶XIV(Sigma),100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素(Gibco-BRL)、無Ca2+、Mg2+,無血清的MEM。.用無菌的細胞刮棒刮氣管內壁，將所得溶液離心后得到游離細胞。.離心后立即用新鮮的上述MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的LHC-8medium(Biofluids)沖洗一次。.沖洗過后，將得到的細胞懸液用臺盼蘭測定活力，若存活率大于90%，則將細胞以106/cm2密度接種于可通透的多聚碳濾膜上(12mmSNAPWELL,Costar)，以37°C5%CO2-95%空氣含5%胎牛血清(Gibco-BRL)and100U/ml青霉素and1