雙脫氧末端終止測序法原理-過程和目標(biāo)基因cDNA序列拼接和分析課件

雙脫氧末端終止法測序的原理、過程和目標(biāo)基因序列的分析1雙脫氧末端終止法測序的原理、過程和目標(biāo)基因序列的分析1

DNA測序技術(shù)主要有兩種方法，都是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)明的。A.

雙脫氧鏈終止法（thechainterminationmethod），是通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈來讀取待測DNA分子的順序。B.

化學(xué)降解法（chemicaldegradationmethod），是將雙鏈DNA分子用化學(xué)試劑處理，產(chǎn)生切口，用同位素標(biāo)記進(jìn)行測序。一、DNA測序的方法2DNA測序技術(shù)主要有兩種方法，都是1.Sanger雙脫氧鏈終止法測序原理利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測定DNA核苷酸順序的方法，是由英國劍橋分子生物學(xué)實驗室的生物化學(xué)家F.Sanger等人于1977年發(fā)明的。31.Sanger雙脫氧鏈終止法測序原理利用D基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區(qū)分長度只差一個核苷酸的DNA分子；利用DNA聚合酶不能夠區(qū)分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP參入到寡核苷酸鏈的3’-末端。因為ddNTP3’不是-OH，不能與下一個核苷酸聚合延伸，從而終止DNA鏈的增長。4基本原理：4552、具體操作：測序時分成四個反應(yīng),每個反應(yīng)除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A,C,G,T核苷三磷酸（稱為ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP）,然后進(jìn)行聚合反應(yīng)。在第一個反應(yīng)中,ddATP會隨機(jī)地代替dATP參加反應(yīng)，一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈，由于其第3位的-OH變成了-H,所以不能繼續(xù)延伸,于是第一個反應(yīng)中所產(chǎn)生的DNA鏈都是到A就終止了。62、具體操作：測序時分成四個反應(yīng),同理第二個反應(yīng)產(chǎn)生的都是以C結(jié)尾的;第三個反應(yīng)的都以G結(jié)尾,第四個反應(yīng)的都以T結(jié)尾,電泳后就可以讀出序列了.7同理第二個反應(yīng)產(chǎn)生的都是以C結(jié)尾的;假如有一個DNA,互補(bǔ)序列是GATCCGAT,我們試著做一下:在第一個反應(yīng)中由于含有dNTP+ddATP,所以遇到G,T,C三個堿基時沒什么問題,但遇到A時,摻入的可能是dATP或ddATP,比如已合成到G,下一個如果參與反應(yīng)的是ddATP則終止,產(chǎn)生一個僅有2個核苷酸的序列:GA,否則繼續(xù)延伸,可以產(chǎn)生序列GATCCG,又到了下一個A了.同樣有兩種情況,如果是ddATP摻入,則產(chǎn)生的序列是GATCCGA,延伸終止,否則可以繼續(xù)延伸,產(chǎn)生GATCCGAT.將得到如下結(jié)果：1產(chǎn)生的都是以A結(jié)尾的片段:GA,GATCCGA。234產(chǎn)生的都是以C結(jié)尾的片段:GATC,GATCC產(chǎn)生的都是以G結(jié)尾的片段:G,GATCCG

產(chǎn)生的都是以T結(jié)尾的片段:GAT,GATCCGAT8假如有一個DNA,互補(bǔ)序列是GATCCGAT,我們試著制得的四組混合物全部平行地點加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列。

即可得到測序結(jié)果：為GATCCGAT9制得的四組混合物全部平行地點加在變性聚丙烯酸受凝膠電制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列3、技術(shù)路線：10制備單鏈模板3、技術(shù)路線：104、高通量自動化測序DNA序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容，一方面是指“分析反應(yīng)”的自動化，另一方面是指“讀片過程”的自動化。自動化的DNA序列分析，也是根據(jù)Sanger雙脫氧鏈終止DNA測序法的基本原理發(fā)展起來的。114、高通量自動化測序DNA序列分析自動化自動化測序原理自動化測序類似于PCR反應(yīng)，但只用一條引物，反應(yīng)混合物中含有不同熒光標(biāo)記的ddNTP與4種dNTP。由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基。產(chǎn)物條帶經(jīng)過檢測儀時給出特定信號，由計算機(jī)判讀并記錄。優(yōu)點：可用雙鏈DNA做模板；模板用量少，不必克??；可實現(xiàn)高通量自動化。12自動化測序原理自動化測序類似于PCR反應(yīng)，但只用一條高速自動DNA測序儀的結(jié)構(gòu)及工作原理由激光發(fā)射器產(chǎn)生的激光束，通過精密的光學(xué)系統(tǒng)后被導(dǎo)向凝膠表面的檢測區(qū)。在此，激光束垂直射向凝膠，同經(jīng)過檢測孔的DNA片段發(fā)生作用，并提供能量激發(fā)熒光發(fā)色基團(tuán)發(fā)射出具特異性波長的熒光。這些熒光通過聚焦鏡集中后傳給濾光鏡/棱鏡組件，以便四種堿基產(chǎn)生的不同標(biāo)記波長區(qū)別開來。經(jīng)成像透像最后由高靈敏度的相機(jī)分段收集信號，傳送給計算所分析處理。13高速自動DNA測序儀的結(jié)構(gòu)及工作原理由激光發(fā)熒光化合物標(biāo)記鏈終止法以熒光顏色為標(biāo)記信號，每種ddNTP各有1種代表顏色；整個反應(yīng)在一個試管中進(jìn)行；當(dāng)新合成的終止單鏈通過熒光監(jiān)測儀時，可由光信號讀出末端核苷酸并由電腦記錄。14熒光化合物標(biāo)記