微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室菌種保存程序

微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室菌種保存程序1．目的規(guī)范菌種保存程序。2．范圍微生物實(shí)驗(yàn)室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌種和來自臨床的標(biāo)本菌株。3．職責(zé)微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員正確執(zhí)行本程序。4．程序4.1需氧菌保存法4.1.1一般保存法見表6-1表6-1常見菌種培養(yǎng)基保存期限菌種培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)基保存溫度保存時(shí)間流感嗜血桿菌18-24脫纖維羊血或脫脂牛奶-206個(gè)月葡萄球菌、鏈球菌18-24血瓊脂斜面（高層加液體石蠟）4—81—3年腸桿菌科18-24Soxbean酪蛋白瓊脂（高層加液體石蠟）4—81年腸桿菌科、非發(fā)酵菌、葡萄球菌等18-24牛肉湯（6份肉湯+4份甘油或10%胰大豆肉湯或10%-15%甘油）-206個(gè)月苛養(yǎng)菌18-245%小牛血清肉湯-206個(gè)月分枝桿菌18-24羅氏培養(yǎng)基（加液體石蠟）4—83個(gè)月幽門螺桿菌18-24心腦浸液或布氏肉湯加入甘油-706年注：保存郡主均需培養(yǎng)18~24h。4.1.2冷凍干燥法將待保存菌培養(yǎng)18~24小時(shí)后，挑取菌落加入一定量的牛肉湯或心腦浸出液加入20%的蔗糖，混勻，分裝于安瓿中，置-70℃低溫冰箱中迅速凍結(jié)，再放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)，抽真空16~24小時(shí)，然后將安瓿封口，置低溫冰箱保存。大多數(shù)菌株可保存10年以上，甚至更長(zhǎng)。4.1.3超冰凍法保存菌株初代培養(yǎng)18~24小時(shí)的菌落、菌苔，加入0.5~1.0ml無菌脫纖維羊血安瓿中，封口，置液氮或-40℃冰箱中保存。4.2厭氧菌保存法4.2.1短期保存方法4.2.1.1皰肉培養(yǎng)基保存法用牛肉渣和牛肉浸出液制成皰肉培養(yǎng)管，接種待保存菌株，然后覆蓋1~2cm的石蠟，再將培養(yǎng)管垂直放置片刻，待石蠟?zāi)讨?5℃培養(yǎng)（無芽胞厭氧菌培養(yǎng)72小時(shí)，普通梭菌培養(yǎng)24小時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌和多枝梭菌培養(yǎng)2周左右），最后置室溫或-20℃保存。發(fā)酵糖類的厭氧菌每個(gè)月轉(zhuǎn)鐘1次，不發(fā)酵糖類的厭氧菌3~6個(gè)月轉(zhuǎn)鐘1次。4.2.1.2半固體培養(yǎng)基保存法在上述液體培養(yǎng)基中加入.0.2%~0.5%瓊脂，制成半固體培養(yǎng)基，接種時(shí)用毛細(xì)管將待保存的厭氧菌的菌液加入半固體培養(yǎng)管底，表面加入1~2cm厚度的液體石蠟，密封管口，培養(yǎng)48小時(shí)，置室溫或-20℃保存。4.2.1.3甘油乳劑培養(yǎng)基保存法在厭氧液體培養(yǎng)基（含胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸液、L-半胱氨酸和維生素K等）中加入少量牛肉渣分裝于長(zhǎng)試管中，接種待保存菌株，置35℃培養(yǎng)48~72小時(shí)，取出后加入無菌甘油（按1:1比例），蓋緊蓋子后用石蠟封口，置4℃或-20℃保存。此法適用于保存脆弱擬桿菌、產(chǎn)黑色素普雷沃菌和具核梭桿菌。4.2.2長(zhǎng)期保存法4.2.2.1低溫冷凍保存法（厭氧菌在低溫條件下新陳代謝處于抑制狀態(tài)，不繁殖也不死亡）培養(yǎng)基包括脫纖維羊血、兔血或馬血，20%脫脂牛乳，7.5%葡萄糖的馬血清。將待保存菌株（培養(yǎng)24~48小時(shí)）加入上述培養(yǎng)基中，封好瓶口，置-70℃液氮或-70℃低溫冰箱中保存。菌種不同造成保存時(shí)間差異，最長(zhǎng)可保存10年，最短可保存2年以上。4.2.2.2冷凍真空干燥法冷凍真空干燥法的培養(yǎng)基（保存劑）有兩種，一種是用10%~20%脫脂牛奶加入0.1%的谷氨酸鈉和0.03%的L-半胱氨酸，煮沸15分鐘消毒，冷卻備用。另一種是用10%蔗糖與馬血清的混合液，過濾滅菌，并置厭氧環(huán)境中預(yù)還原，分裝備用。將培養(yǎng)48小時(shí)左右（處于生長(zhǎng)靜止期）的厭氧菌落或菌苔刮下，加入一定量的上述培養(yǎng)基，混勻分裝于安瓿中，置-20℃低溫冰箱中迅速凍結(jié)，再放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)，抽真空16~24小時(shí)，然后將安瓿封口，置4℃環(huán)境下長(zhǎng)期保存。4.3結(jié)核分枝桿菌保存法4.3.1短期保存方法（懸浮液低溫保存法）結(jié)核分枝桿菌充分懸浮于經(jīng)高壓滅菌的20%丙三醇-生理鹽水中，保藏在-20℃。使用該方法，大部分分枝桿菌能保存1年以上。4.3.2長(zhǎng)期保存方法（懸浮液超低保存法）10mg結(jié)核分枝桿菌充分懸浮于凍存溶液（6g胰蛋白胨溶于100ml20%丙三醇水溶液）中，保藏溫度-70℃。使用該方法，大部分分枝桿菌能保存5年以上。4.4真菌菌種保存法4.4.1冰凍保存法冰凍保存有助于抑制真菌，尤其是抑制皮膚癬菌發(fā)生多形性變化，即變異（當(dāng)其培養(yǎng)物變成白色蓬松絨毛狀時(shí)，真菌就失去所有特征性的顏色及形態(tài)學(xué)特征，甚至?xí)Ｖ巩a(chǎn)生各種孢子，由此會(huì)導(dǎo)致菌種鑒定困難）。真菌接種在沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)8~10日或直至見到菌落將近要全面覆蓋培養(yǎng)基時(shí)，將試管置于-20℃冰箱中保存。4.4.2石蠟油保存法真菌接種于沙氏瓊脂上，25℃培養(yǎng)，酵母菌2~4日，產(chǎn)孢子的絲狀真菌需形成成熟的孢子，不產(chǎn)孢子的真菌生長(zhǎng)成健壯的菌絲為止。覆蓋2cm的無菌石蠟（礦物）油（石蠟油的滅菌一般在1小時(shí)以上，然后將自然冷卻的石蠟油加入含真菌的試管中，使液面高于斜面頂部1cm左右）。使用此方法，許多真菌可在室溫下存活數(shù)年。在恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)，先從石蠟油下面挑取一小塊（2~3mm3）菌落，沿試管壁邊挑取邊擠壓過多的石蠟油（因石蠟油過多會(huì)抑制真菌生長(zhǎng)），然后接種于沙氏瓊脂斜面上，培養(yǎng)數(shù)日并觀察生長(zhǎng)情況。4.4.3水保存法將真菌接種于培養(yǎng)基的斜面上，待培養(yǎng)成熟后，將無菌蒸餾水直接注入試管中，沖洗下孢子和菌絲，簡(jiǎn)便易行，經(jīng)濟(jì)，效果好。在恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)，取混懸液接種于SDA培養(yǎng)基中即可。大多數(shù)真菌均可用這種方法保存數(shù)年（最長(zhǎng)12年）。參考文獻(xiàn)[1]周庭銀編著.《臨床微