金屬-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研究進(jìn)展

金屬-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研究進(jìn)展

1細(xì)菌耐藥機(jī)制近年來(lái)，細(xì)菌對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性逐漸成為臨床抗感染治療的主要威脅。其中-內(nèi)酰胺酶的出現(xiàn)是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的主要機(jī)制之一。β-內(nèi)酰胺酶被分為A、B、C、D四類。其中A、C、D類依賴活性位點(diǎn)中的Ser殘基發(fā)揮水解活性,而B(niǎo)類依賴活性中心的金屬離子,故被稱為金屬β-內(nèi)酰胺酶(Metallo-β-lactamase,MBL)雖然越來(lái)越多的金屬酶抑制劑被報(bào)道2材料和方法2.1肽分子與nd-1的對(duì)接不少含有巰基的化合物已被報(bào)道對(duì)MBLs有較好的抑制活性,其中不乏基于氨基酸結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的巰基衍生物然后用分子對(duì)接的方法模擬三肽分子與NDM-1的結(jié)合模式。對(duì)接過(guò)程在MOE2014中完成,NDM-1的晶體結(jié)構(gòu)取自PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(PDBID:3Q6X)。首先對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)加氫、質(zhì)子化,將結(jié)構(gòu)中的原有配體周圍口袋定義為活性位點(diǎn)。構(gòu)建三肽分子并進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化及質(zhì)子化處理,對(duì)接方法選擇ProxyTriangle,打分函數(shù)選擇LondondG。2.2ndm-1金屬酶的檢測(cè)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)量實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建pET-28a-NDM-1-E.coliBL21(DE3)的重組菌株,NDM-1的表達(dá)、純化方法參考文獻(xiàn)2.33.3醇對(duì)nd-1的抑制作用的測(cè)定2.3.1酶解時(shí)間的確定在吉爾生化(上海)有限公司合成三肽分子。依據(jù)NDM-1的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn),我們選擇頭孢呋辛鈉作為報(bào)告底物,在260nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度隨酶水解時(shí)間的變化,計(jì)算反應(yīng)初速度。反應(yīng)的緩沖液體系為含Zn2.3.2三醇分子與抗生素聯(lián)合抗菌活性的測(cè)定重組菌株pET-28a-NDM-1-E.coliBL21(DE3)復(fù)蘇后挑取單菌落培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD3結(jié)果與討論3.1nd-1的純化及動(dòng)力學(xué)參數(shù)實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建好pET-28a-NDM-1-E.coliBL21(DE3)的重組菌株(NDM-1的N端添加了His-tag以便后續(xù)純化),在20℃下誘導(dǎo)表達(dá)20h后收集菌體,經(jīng)超聲破碎后對(duì)上清中的NDM-1采用鎳柱親和層析法進(jìn)行分離、純化,純化結(jié)果如圖2所示。以青霉素(氨芐西林)、頭孢菌素(頭孢呋辛、頭孢唑肟)及碳青霉烯類(美羅培南)抗生素為底物,測(cè)定NDM-1水解動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。結(jié)果顯示NDM-1對(duì)經(jīng)典青霉素類抗生素氨芐西林的水解速率(K3.2nd-1的相互作用NDM-1屬于B1類金屬β-內(nèi)酰胺酶,其活性位點(diǎn)處有兩個(gè)Zn離子,Zn1與H120–H122–H189(3H位點(diǎn))配位,Zn2與D124–C208–H250(DCH位點(diǎn))配位。氨芐西林及卡托普利與NDM-1的相互作用模式如圖3所示。氨芐西林的酰胺氧與Zn1配位,羧基氧與Zn2配位,卡托普利的巰基同時(shí)與兩個(gè)鋅離子配位,這是配體與NDM-1之間最重要的相互作用鍵。另外,氨芐西林還與NDM-1的Q123和E152形成氫鍵,卡托普利與N220形成氫鍵。通過(guò)分子對(duì)接方法研究三肽分子與NDM-1的相互作用。如圖3所示,含有半胱氨酸的三肽游離巰基均能與鋅離子發(fā)生配位,其中FCf、Fcf、FCp和Fcp的巰基同時(shí)與兩個(gè)鋅離子配位,而fCp和fcp上的巰基只與Zn2配位,其羧基Zn1配位。FCf、FCp和Fcp還與K211形成氫鍵,FCf、Fcf、Fcp和fcp與N220形成氫鍵,FCf還與Q123形成氫鍵。3.3三醇對(duì)nd-1的抑制作用3.3.1三醇對(duì)nd-1的抑制作用三肽分子對(duì)NDM-1的抑制活性IC3.3.2肽的抗菌活性三肽分子在終濃度為200μmol/L時(shí)與頭孢呋辛聯(lián)用對(duì)重組NDM-1大腸埃希菌的抑菌效果如表3所示。當(dāng)頭孢呋辛濃度為0μmol/L時(shí),6條三肽分子均不能抑制大腸埃希菌生長(zhǎng),說(shuō)明三肽本身無(wú)抗菌活性;FCf與頭孢呋辛聯(lián)用的抑菌效果比較明顯,使頭孢呋辛對(duì)NDM-1重組菌的MIC由128μg/mL降低至32μg/mL,降低4倍;當(dāng)半胱氨酸變?yōu)镈型時(shí),Fcf與頭孢呋辛聯(lián)用的抑菌效果下降,MIC變?yōu)?4μg/mL;三肽C端D-Phe變成D-Pro或者N端L-Phe變成D-Phe時(shí),與FCf相比,聯(lián)合抑菌效果均降低,其中fCp和fcp沒(méi)有使頭孢呋辛的MIC降低,說(shuō)明無(wú)聯(lián)合抑菌效果。由此可見(jiàn),聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果與3.3.1中的IC4表面活性劑的設(shè)計(jì)及合成近年來(lái),細(xì)菌耐藥性的發(fā)展使得金屬-β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研發(fā)倍受關(guān)注,而多肽類抗生素的耐藥性發(fā)展相對(duì)較慢,且對(duì)臨床上多重耐藥菌的治療效果可觀,因此開(kāi)發(fā)新型多肽類抗菌藥物具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文基于NDM-1的底物氨芐西林和抑制劑卡托普利的結(jié)構(gòu),通過(guò)理性設(shè)計(jì)得到6條含有Cys的三肽。相互作用模式分析發(fā)現(xiàn)它們的游離巰基均能與NDM-1的鋅離子配位,與卡托普利和NDM-1的關(guān)鍵作用模式類似。通過(guò)對(duì)NDM-1的抑