正葡萄糖鉗夾實驗課件

口服胰島素腸溶膠囊的藥代動力學與藥效動力學研究實驗口服胰島素腸溶膠囊的藥代動力學與藥效動力學研究實驗1一、高胰島素--正葡萄糖鉗夾技術(shù)一、高胰島素--正葡萄糖鉗夾技術(shù)2（一）、歷史背景

1966年Andres等根據(jù)葡萄糖一胰島素的負反饋原理，創(chuàng)立了一種可定量分析胰島素分泌及作用的方法——葡萄糖鉗夾技術(shù)。1979年DeFronzo等對該技術(shù)從理論上作了詳細的闡述，并給予技術(shù)指導，推動了世界范圍的廣泛應用。萄糖鉗夾技術(shù)根據(jù)研究目的的不同又劃分為高糖鉗、正糖鉗及低糖鉗等不同方法。（二）、技術(shù)原理1、葡萄糖一胰島素負反饋體系

血糖升高時，胰島素分泌增加，并通過增加攝取、儲存和利用葡萄糖等方式，下調(diào)血糖；血糖下降，胰島素分泌降低，胰高血糖素等升糖激素增加，促進代謝分解，加速糖原分解和葡萄糖異生作用，升高血糖。（一）、歷史背景32、鉗夾技術(shù)原理正糖鉗技術(shù)通過同時輸注可控濃度及速率的外源性胰島素和葡萄糖，打破體內(nèi)葡萄糖一胰島素的負反饋調(diào)控，使血漿外源性胰島素維持在較高濃度水平，而血糖維持在基礎(chǔ)穩(wěn)態(tài)水平。由于血漿外源性胰島素的優(yōu)勢濃度，抑制了內(nèi)源性葡萄糖(肝糖分解和糖異生)和內(nèi)源性胰島素分泌，此時外源性葡萄糖輸注速率等于外周組織的葡萄糖利用率，從而評價葡萄糖、胰島素以及其他相關(guān)物質(zhì)的代謝過程。2、鉗夾技術(shù)原理4（三）、特點1、避免了內(nèi)源性胰島素缺乏(如糖尿病患者)及低血糖(如胰島素耐量試驗中)對胰島素敏感性測定的影響。2、將內(nèi)源性干擾減至最小，增加了實驗的可控性與準確性，降低了結(jié)果的變異性。（四）、缺點1、不同受試者的應激反應和血管緊張度等諸多因素會對穩(wěn)態(tài)的建立產(chǎn)生一定的影響。2、該技術(shù)復雜耗時、費用昂貴，實驗中需頻繁取血。（五）、實驗方法1、建立靜脈輸液通道及采血通道在前臂靜脈或正中靜脈穿刺并留置導管建立輸液通道，用于輸入胰島素和葡萄糖溶液。葡萄糖和胰島素輸注通道經(jīng)三通管與靜脈通道聯(lián)接。采血通道由輸液器、三通管、帶延長的三通管、靜脈留置針依次串連在一起，2個三通管的側(cè)孔分別接上注射器，并保持管道通暢。（三）、特點52、鉗夾實驗試驗前比格犬禁食12h，試驗時用巴甫洛夫吊帶將比格犬固定于實驗臺上。在動物一側(cè)前肢建立靜脈通道，該通道連接三通管，一端連接胰島素注射泵，一端連接葡萄糖輸注泵。鉗夾開始后10min內(nèi)以較快的速度輸注胰島素，以使血胰島素水平快速升高，而后以較低的速度持續(xù)輸注維持一定血胰島素濃度。在靜脈通道對側(cè)前肢取血測量血糖，每隔5min取血測量血糖一次，通過調(diào)節(jié)葡萄糖輸注率以維持血糖水平恒定。經(jīng)一段時間后、血糖恒定維持于平衡狀態(tài)。給胰島素制劑后,葡萄糖輸注率隨著胰島素產(chǎn)生的作用變化，以此來評價胰島素制劑的藥效動力學特征。2、鉗夾實驗63、正糖鉗技術(shù)指標①鉗夾穩(wěn)定狀態(tài)下血糖(SSPG)：SSPG需控制在正?？崭寡恰?0％范圍內(nèi)。②鉗夾穩(wěn)定狀態(tài)下胰島素(SSINS)：較高的血漿外源性胰島素水平才能抑制內(nèi)源性肝糖及胰島素的生成，滿足實驗要求。③血糖變異系數(shù)(CVBG)：鉗夾實驗期間CVBG可反映鉗夾技術(shù)的穩(wěn)定性與準確性。④穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注速率(SSGIR)：SSGIR等于外周組織的葡萄糖利用率，可用來評價外周組織(主要是肌肉組織)胰島素作用，反映機體組織的胰島素敏感性。⑤內(nèi)源性胰島素分泌：c肽水平可評估內(nèi)源性胰島素分泌，粗略判斷內(nèi)源性胰島素分泌的抑制程度。3、正糖鉗技術(shù)指標7二、RIA方法測定血清樣品中胰島素抗原濃度二、RIA方法測定血清樣品中胰島素抗原濃度8（一）原理將一定量的胰島素標記示蹤物和待測樣品混合，加入豬胰島素抗體,通過標記示蹤物和待測樣品與抗體的特異性競爭結(jié)合。加入沉淀劑后,與抗體結(jié)合的標記示蹤物在沉淀中，結(jié)合的標記示蹤物與待測胰島素樣品的量成反比。γ計數(shù)儀計數(shù)越高，對應的胰島素樣品的濃度越低。（二）實驗方法1、采樣各組動物于給予胰島素制劑前及給藥后每隔30min取血,直至鉗夾結(jié)束。全部血樣均于凝固后離心獲得血清，血清樣品于-20℃保存。采用RIA方法檢測其中的豬胰島素抗原濃度，用于胰島素血清藥代動力學的計算。（一）原理92、測定NSB管(非特異性結(jié)合管)加300ml分析液，Bo管(參比管)加200ml分析液，其他管加100ml分析液。在其它分析管中加100oL標準品、質(zhì)控樣品或待測血清樣品，各管加入100μl125I-Insulin，然后各管(除Totalcount

tubes與NSB管)加入100ml豬胰島素抗體，混合均勻，封閉，4oC過夜。20小時以后各管加1ml的冷凍沉淀劑，渦旋，孵育20min，4oC。離心30min，立即傾出上清，于γ計數(shù)儀上計數(shù)各管。各批分別設(shè)置豬胰島素標準校正曲線，用以計算該批所測未知樣品濃度。2、測定10（三）結(jié)果計算用MicroCal公司Origin5.0對濃度對數(shù)和各管放射計數(shù)與總計數(shù)的比值對數(shù)繪制標準曲線，四參數(shù)Logistic擬合：（四）PKPD參數(shù)的計算和統(tǒng)計分析用MierosoftExee1XP軟件采用統(tǒng)計矩方法計算各藥效動力學與藥代動力學參數(shù)。PK或PD曲線下面積用梯形法進行計算。達峰時間與峰濃度均為實測值。比格大自身交叉對照組數(shù)據(jù)比較用Student‘S配對t一檢驗法進行統(tǒng)計判斷,其它處理組組間t一檢驗進行統(tǒng)計學判斷。用Origin軟件對實驗結(jié)果進行線性回歸求回歸方程及相關(guān)統(tǒng)計參數(shù)，并作圖。（三）結(jié)果計算（四）PKPD參數(shù)的計算和統(tǒng)計分析11三、相關(guān)分析技術(shù)三、相關(guān)分析技術(shù)12（一）放射免疫分析(RIA)方法

放射免疫技術(shù)為一種將放射性同位素測量的高度靈敏性、精確性和抗原抗體反應的特異性相結(jié)合的體外測定超微量物質(zhì)的新技術(shù)。應用放射性同位素標記的抗原或抗體，通過免疫反應測定的技術(shù)，都可稱為放射免疫技術(shù)，經(jīng)典的放射免疫技術(shù)是標記抗原與未標抗原競爭有限量的抗體，然后通過測定標記抗原抗體復合物中放射性強度的改變，測定出未標記抗原量。它可以分為兩類：競爭性RIA和非競爭性RIA，也稱為免疫放射分析。（一）放射免疫分析(RIA)方法13（二）統(tǒng)計矩方法1、應用藥物動力學研究的統(tǒng)計矩分析，是一種非隔室的分析方法，它不需要對藥物設(shè)定專門的隔室，也不必考慮藥物的體內(nèi)隔室模型特征。2、目前這種分析方法主要適用于體內(nèi)過程符合線性動力學的藥物。（三）t一檢驗