熒光光譜的原理及應用課件

熒光光譜的原理及其在分子自組裝中的應用鄭永麗上海交通大學化學化工學院20131115熒光光譜的原理及其在分子自組裝中的應用鄭永麗1主要內容概述熒光光譜法原理熒光的光譜特性我們有關熒光的工作主要內容概述2概述概述3熒光光譜的原理及應用ppt課件4基本概念能級:

現代量子物理學認為原子的可能狀態(tài)是不連續(xù)的，因此各狀態(tài)對應能量也是不連續(xù)的。這些能量值就是能級熒光：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。磷光：從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。分子熒光光譜法(Molecularfluorescencespectroscopy)：又稱為熒光光譜法或熒光分析法．是以物質所發(fā)射的熒光強度與濃度之間的線性關系為依據進行的定量分析，以熒光光譜的形狀和熒光峰對應的波長進行的定性分析．基本概念能級:現代量子物理學認為原子的可能狀態(tài)是不連續(xù)的，5熒光分析法的特點靈敏度高。檢測限比吸收光譜法低1-3個數量級；選擇性比吸收光譜法好。因為能產生紫外可見吸收的分子不一定發(fā)射熒光或磷光；試樣用量少和方法簡便能提供比吸收光譜多的物理參數應用范圍不如吸收光譜法廣，因為有的分子不發(fā)熒光。熒光分析法的特點靈敏度高。檢測限比吸收光譜法低1-3個數量級6熒光光譜法原理熒光光譜法原理7發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關吸收光譜與發(fā)射光譜鏡像關系Stocksshift熒光和磷光的產生發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關吸收光譜與發(fā)射光譜鏡像關系Sto8熒光的光譜特性熒光的光譜特性9熒光特性參數穩(wěn)態(tài)波長和強度偏振性能量子產率瞬態(tài)熒光壽命磷光磷光壽命磷光光譜熒光特性參數穩(wěn)態(tài)波長和強度偏振性能量子產率瞬態(tài)熒光壽命磷光10波長和強度波長和強度11基本概念激發(fā)波長：固定熒光的發(fā)射波長而不斷改變激發(fā)光的波長，并記錄相應的熒光強度，所得到的熒光強度對激發(fā)波長的譜圖稱為熒光的激發(fā)光譜。發(fā)射波長：固定激發(fā)光的波長而不斷改變熒光的測定波長并記錄相應的熒光強度，所得到的熒光強度對發(fā)射波長的譜圖則為熒光的發(fā)射波長。圖熒光染料C-540A的激發(fā)和發(fā)射光譜基本概念激發(fā)波長：固定熒光的發(fā)射波長而不斷改變激發(fā)光的波長，12基本概念測試方法：1)判斷激發(fā)波長：①根據分子結構判斷；②參照吸收光譜；③三維掃描2)以判斷的波長為激發(fā)，做發(fā)射掃描，可以得到發(fā)射波長3)利用得到的發(fā)射波長，進行激發(fā)掃描，即可得到激發(fā)波長強度：

比爾-朗伯定律If=2.303YfI0εbc應用：定性和定量基本概念測試方法：13熒光波長和強度與結構的關系①躍遷類型（pi->pi*熒光比較強，即有雙鍵的物質熒光強）②共軛效應（共軛體系是pi電子更容易被激發(fā)，熒光強）③剛性平面結構（有這種結構的分子可以減小分子的振動，碰撞失活可能性小，熒光強）④取代基效應（給電子基團，熒光增強；吸電子基團，熒光減弱甚至猝滅）熒光波長和強度與結構的關系①躍遷類型（pi->pi*熒光比較14熒光強度與環(huán)境因素的關系溶劑①溶劑極性可增加或降低熒光強度；②與溶劑作用從而改變熒光物質結構來增加或降低熒光強度。溫度溫度升高，熒光強度下降(因為內、外轉換增加、粘度或“剛性”降低)。內濾光和自吸體系內存在可以吸收熒光的物質，或熒光物質的熒光短波長與激發(fā)光長波長有重疊，稱為內濾光；熒光物質濃度較大，吸收自身的熒光發(fā)射，稱為熒光自吸。pH值具酸或堿性基團的有機物，在不同pH值時，其結構可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變熒光強度與環(huán)境因素的關系溶劑①溶劑極性可增加或降低熒光強度；15有序介質的影響(表面活性劑)CMC有序介質的影響(表面活性劑)CMC16熒光量子產率熒光量子產率17基本概念定義：

熒光物質吸光后所發(fā)射的熒光的光子數與所吸收的激發(fā)光的光子數之比值.(Y)測試方法：①參比法Yu=YS·(Fu/Fs)·(As/Au

)·(nu/ns)(A<0.05)；②直接測量法，要求儀器有積分球注意事項：

溫度，溶劑，激發(fā)波長，濃度應用：量子產率取決于輻射和非輻射躍遷過程，即熒光發(fā)射、系間跨越、外轉移和內轉移等的相對速率基本概念定義：18常用物質的量子產率Q.Y.StandardsQ.Y.[%]ConditionsforMeasurementExcitation[nm]Cy34PBS540Cy527PBS620CresylViolet53Methol580Fluorescein950.1MNaOH,220C496popop97Cyclohexane300Quininesulfate580.1MH2SO4,220C350Rhodamine101100Ethanol450Rhodamine6G95Water488RhodamineB31Water514Tryptophan13Water,200C280L-Tyrosine14Water270常用物質的量子產率Q.Y.StandardsQ.Y.Con19熒光偏振熒光偏振20基本概念定義：測量：

①L-型或者單通道法

②T-型多通道法應用：流動性,分子基本性質,酶學

分子相互作用,熒光偏振免疫,成像常用偏振研究的熒光分子：

1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)；羅丹明B；2-苯胺基-6-萘磺酸鈉(2,6-ANS)基本概念定義：21熒光光譜的原理及應用ppt課件22熒光共振能量轉移(FRET)熒光共振能量轉移(FRET)23基本概念定義：

當一個熒光分子（又稱為供體分子，Donor）的熒光光譜與另一個熒光分子（又稱為受體分子，Acceptor）的激發(fā)光譜相重疊時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減。FRET現象的特征:

選擇性激發(fā)供體,卻能檢測到受體發(fā)射的熒光基本概念定義：24FRET需要條件供體分子的發(fā)射光譜和受體分子的吸收光譜必須有顯著的重迭，一般大于30％；供體分子和受體分子間的距離必須在1-10nm之間.D和A間的FRET效率：R0:E=50%時供體和受體分子間的距離

對于特定的供體受體對是常數;R:供體和受體分子間的距離.E:FRET效率.對于R特別靈敏供體分子的發(fā)射態(tài)偶極矩與受體分子的吸收態(tài)偶極矩、以及它們的向量必須滿足一定的條件FRET需要條件供體分子的發(fā)射光譜和受體分子的吸收光譜必須有25應用檢測兩個發(fā)光分子間的重合與共定位檢測分子間的相互作用檢測分子的折疊與構象變化應用檢測兩個發(fā)光分子間的重合與共定位26

供體-受體熒光分子對BFP-GFP

BFP-YFP

CFP-YFP

CFP-dsRED

GFP-dsRED綠色熒光蛋白類(GreenFluorescentProteins,GFPs)染料類(Dye)FITC-Rhodamine

Alexa488-Cy3

Cy3-Cy5

供體-受體熒光分子對BFP-GFP

BFP-YFP27熒光壽命熒光壽命28基本概念定義：當激發(fā)光切斷后熒光強度衰減至原強度的1/e所經歷的時間。它表示了熒光分子的S1激發(fā)態(tài)的平均壽命。測試方法：①時間相關單光子記數法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC);②相調制法(PhaseModulationMethods)③頻閃技術(StrobeTechniques).應用：

熒光壽命與物質所處微環(huán)境的極性、粘度等條件有關，因此可以通過熒光壽命直接了解所研究體系發(fā)生的變化?；靖拍疃x：當激發(fā)光切斷后熒光強度衰減至原強度的1/e所經29熒光壽命的計算

熒光壽命的計算

30熒光測試技術同步熒光測定；導數熒光測定；三維熒光光譜技術時間分辨熒光測定；相分辨熒光測定；熒光偏振測定；熒光免疫測定；低溫熒光測定；固體表面熒光測定；近紅外熒光分析法；熒光反應速率法熒光顯微與成像技術；空間分辨熒光技術熒光探針技術；單分子熒光檢測技術；熒光光纖化學傳感器熒光測試技術同步熒光測定；導數熒光測定；三維熒光光譜技術31常用熒光探針探針Ex(nm)Em(nm)探針Ex(nm)Em(nm)1,8-ANS372480Cy3550570Hydroxycoumarin325386Hoechst33342343483Aminocoumarin350445EthidiumBromide493620NBD466536Fluo-3(膜穿透性)506526Fluorescein495519DPH362432RhodamineB570590EGFP488507AlexaFluro350343442Calcein496517常用熒光探針探針Ex(nm)Em(nm)探針Ex(nm)Em32我們有關熒光的工作我們有關熒光的工作33熒光穩(wěn)態(tài)模塊磷光模塊顯微熒光模塊系統(tǒng)總圖熒光壽命模塊熒光穩(wěn)態(tài)模塊磷光模塊顯微熒光模塊系統(tǒng)總圖熒光壽命模塊34圖

熒光分光光度計的光學系統(tǒng)圖熒光分光光度計的光學系統(tǒng)35兩親性超支化聚合物分子自組裝HBPO-star-PEO兩親性超支化聚合物分子自組裝HBPO-star-PEO36熒光光譜法研究內容聚合物CMC的測定熒光猝滅法測量分子的分布能量共振轉移制備熒光呼吸囊泡熒光偏振測量分子的流動性熒光壽命研究體系微環(huán)境發(fā)光聚合物熒光性能的測定熒光光譜法研究內容聚合物CMC的測定37聚合物CMC的測定芘不溶于水，溶于乙醇、乙醚、甲苯、四氫呋喃等有機溶劑。隨著溶劑的極性增加，I1/I3降低，因而可以用于聚合物組裝的研究JournalofPolymerScience,PartA:PolymerChemistry48(20),pp.4428-4438聚合物CMC的測定芘不溶于水，溶于乙醇、乙醚、甲苯、四氫呋喃38能量共振轉移制備熒光呼吸囊泡B)SchematicrepresentationoftheprotonationanddeprotonationofPEG-b-PDMA-AzointheC)Steady-statefluorescencespectraofthevesicularsolutionatpHvaluesbetween4and12D)ReversiblepH-inducedchangeinthefluorescenceuponthealternateadditionofHClandNaOH能量共振轉移制備熒光呼吸囊泡B)Schematicrep39發(fā)光聚合物熒光性能的測定發(fā)光聚合物熒光性能的測定40參考書目JonathanD.Violin,etal.,AgeneticallyencodedfluorescentreporterrevealsoscillatoryphosphorylationbyproteinkinaseC.JCellBiology,2003,161:899–909ElizabethAJetl.,FRETImaging.NatureBiotechnology,2003,21:13887-1395RajeshBS.Fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)microscopyimagingoflivecellproteinlocalizations.JCellBiology,2003,160:629–633JinZhang,etal.,.GeneticallyencodedreportersofproteinkinaseAactivityrevealimpactofsubstratetethering.PNAS,2001,98:14997–15002MichaelG.Erickson,etal.,DsRedasaPotentialFRETPartnerwithCFPandGFP.BiophysicalJournal,2003