典型藥物生產(chǎn)工藝-維生素C的生產(chǎn)工藝

學(xué)習(xí)情境三維生素C的生產(chǎn)工藝一、維生素類藥物1、基本概念維生素是生物體內(nèi)一類量微、化學(xué)結(jié)構(gòu)各異，具有特殊功能的小分子有機化合物，它們大多需從外界攝取。第一節(jié)概述2、維生素的特點①維生素不是構(gòu)成機體組織和細胞的組成成分，它也不會產(chǎn)生能量，它的作用主要是參與機體代謝的調(diào)節(jié)。②大多數(shù)的維生素，機體不能合成或合成量不足，不能滿足機體的需要，必須經(jīng)常通過食物中獲得。③人體對維生素的需要量很小，日需要量常以毫克（mg）或微克（μg）計算，但一旦缺乏就會引發(fā)相應(yīng)的維生素缺乏癥，對人體健康造成損害。

維生素分為脂溶性和水溶性兩大類。脂溶性：維生素A，D，E，K等。水溶性：維生素B1、B2、B3（煙酸）、B5（泛酸）、B6、B7、B9（葉酸）、B12、維生素C等。

維生素A

——夜盲癥、干眼癥、視神經(jīng)萎縮等，還會引起皮膚干燥粗糙，抵抗力弱，頭發(fā)干燥，指甲易斷裂等癥狀，還容易造成抵抗力弱，易生?。痪S生素B1

——神經(jīng)炎、腳氣病、魏尼凱氏失語癥等，還可引起便秘、消化不良，注意力不集中、健忘，肌肉疼痛無力，情緒不穩(wěn)定，食欲減退，容易疲倦等；維生素B2

——脂溢性皮炎、口腔炎，長青春痘，頭發(fā)分叉斷裂，指甲斷裂，眼睛布滿血絲等；維生素B3

——失眠、口腔潰瘍、癩皮病，皮膚炎、紅疹、脫皮，食欲差、腹瀉，精神緊張、躁動不安，易疲倦，皮膚粗糙易產(chǎn)生皺紋等；維生素B5

——憂郁、焦慮，肌肉容易抽筋，失眠、容易疲倦，頭發(fā)容易枯黃斷裂，食欲不振、消化不良、十二指腸潰瘍，手腳末梢有刺麻感等；

維生素B6

——肌肉痙攣、過敏性濕疹，暴躁易怒，經(jīng)前癥候群，皮膚炎，情緒不穩(wěn)定，貧血等；維生素B9

——惡性貧血；維生素B12——惡性貧血，記憶力減退，月經(jīng)不調(diào)，肌肉無力，胃腸障礙，食欲不振、體重減輕；維生素C

——壞血?。痪S生素D

——軟骨?。ㄘE?。?；維生素E

——不育癥、習(xí)慣性流產(chǎn)等；維生素K

——凝血酶缺乏，不易止血，胃腸不適，嚴重腹瀉等二、維生素C的發(fā)現(xiàn)1497年7月9日到1498年5月30日，葡萄牙航海家達伽馬發(fā)現(xiàn)繞過非洲到達印度的航線，他的160個船員中，有100多人死于壞血病。1519年，葡萄牙航海家麥哲倫率領(lǐng)的遠洋船隊從南美洲東岸向太平洋進發(fā)。三個月后，有的船員牙床破裂了，有的船員流鼻血，有的船員渾身無力，待船到達目的地時，原來的200多人，活下來的只有35人，人們對此找不出原因。1536年法國探險家在發(fā)現(xiàn)圣勞倫斯河之后，溯流而上抵達魁北克過冬。探險隊中24人死于壞血病，其它多人也都病重。有一位印第安人教他們飲用一種arborvitae樹葉泡的茶，就治好了這些人。后來發(fā)現(xiàn)這種樹的葉子里每100克含有50毫克的維生素C。1734年，在開往格陵蘭的海船上，有一個船員得了嚴重的壞血病，當時這種病無法醫(yī)治，其它船員只好把他拋棄在一個荒島上。待他蘇醒過來，用野草充饑，幾天后他的壞血病竟不治而愈了。諸如此類的壞血病，曾奪去了幾十萬水手的生命。1747年英國海軍醫(yī)官詹姆斯·林德在船上做了這個現(xiàn)在很著名的實驗，12個嚴重的壞血病海員，大家都吃完全相同的食物，唯一不同的藥物是當時傳說可以治療壞血病的藥方。兩個病人每天吃兩個橘子和一個檸檬，另兩人喝蘋果汁，其它人是喝稀硫酸，酸醋，海水，或是一些其它當時人認為可治壞血病的藥物。6天之后，只有吃新鮮柑橘水果的兩人好轉(zhuǎn)，其它人病情依然。經(jīng)過長期的研究，科學(xué)家后來從新鮮的水果和蔬菜中提取出維生素C（又叫抗壞血酸），并證實壞血病就是維生素C缺乏癥。三、維生素C的特點（必需維生素的特點）1、調(diào)節(jié)性維生素類是天然食物中的一種成分，不能供給能量，也不是組織細胞的結(jié)構(gòu)成分，是一種活性物質(zhì)，對新陳代謝起調(diào)節(jié)和整合作用。2、微量性成人每天需攝入50～100mg。過量癥狀：腹瀉。3、外源性人體內(nèi)不能合成，必須從外界攝取。1907年挪威化學(xué)家霍爾斯特在檸檬汁中發(fā)現(xiàn)，1932年才獲得純品，現(xiàn)已可人工合成。主要食物來源：柑桔類水果、蔬菜等。4、特異性缺乏癥狀：壞血病。能夠治療壞血病并且具有酸性,所以稱作抗壞血酸。四、維生素C結(jié)構(gòu)與性質(zhì)維生素C，維他命C，L-抗壞血酸，是一種水溶性維生素。分子式：C6H8O6；分子量：176.13g/mol；外觀：無色晶體；熔點：190-192℃；紫外吸收最大值：245nm；維生素C(多羥基不飽和內(nèi)酯衍生物)分子中有兩個手性碳原子，故有4種光學(xué)異構(gòu)體，其中L-抗壞血酸效果最好，其他三種臨床效果很低或無效。D-甘油醛

L-甘油醛

理化性質(zhì)：1、水溶性本品易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿和石油醚等有機溶劑。2、酸性水溶液顯酸性反應(yīng)。3、還原性本品結(jié)晶體在干燥空氣中較穩(wěn)定，但其水溶液能被空氣中氧和其它氧化劑所破壞，故貯藏時要陰涼干燥，密閉避光。4、水解性

水溶液在pH5-6之間穩(wěn)定：若pH值過高或過低，并在空氣、光線和溫度的影響下．可促使內(nèi)酯環(huán)水解．并可進一步發(fā)生脫羧反應(yīng)而成糠醛，聚合后易變色。這是本品在貯存中變色的主要原因。水解反應(yīng)過程如下。四、維生素C生產(chǎn)現(xiàn)狀維生素C是目前全球維生素生產(chǎn)廠家競爭最激烈的一塊，也是中國企業(yè)直接加入并具有相當實力的一塊。市場格局可謂三足鼎立，即羅氏公司、巴斯夫公司和中國4家公司，具有明顯優(yōu)勢的是前兩者，羅氏的市場份額達到40％，而巴斯夫在兼并日本武田的維生素C銷售網(wǎng)絡(luò)后，市場份額達到28％，剩余約30％的市場由包括中國4家企業(yè)（國內(nèi)維生素C四巨頭---東北制藥、石藥維生藥業(yè)、華藥維爾康藥業(yè)和江蘇江山藥業(yè)。這四家企業(yè)目前總產(chǎn)量接近10萬噸，占據(jù)了國內(nèi)市場90%以上的份額），出口量占87%，在國際市場上占據(jù)著一半以上份額。

現(xiàn)在中國已經(jīng)掌握了維生素C生產(chǎn)的領(lǐng)導(dǎo)地位，應(yīng)該可以徹底解決病毒的問題，只是出產(chǎn)的維生素C大部份都外銷，中國人服用維生素C的平均劑量，遠遜于歐美和日本。如果我們普遍認識到維生素C預(yù)防和治療病毒傳染病癥的原理并且按量服用，就可以預(yù)防很多病毒的傳播。維生素C的真正效用，會顯示在治療禽流感，SARS和AIDS等更嚴重的病毒傳染病上。

在19世紀30年代以前，VC是從檸檬中提取的，價格昂貴，遠不能滿足人們的需要。第二節(jié)合成路線一、萊氏法1933年德國萊奇司登（Reisehstein）等用化學(xué)合成法制備VC獲得成功，后1935年進一步改進為由一步發(fā)酵和化學(xué)合成來生產(chǎn)VC，即以D-山梨醇為原料，經(jīng)黑醋菌一步發(fā)酵得L-山梨糖，再經(jīng)丙酮酮醇縮合、次氯酸鈉氧化及鹽酸轉(zhuǎn)化等5步制備維C獲得成功。此方法通稱為萊氏法

。這個方法的專利權(quán)在1934年被羅氏公司購得，成為50余年來工業(yè)生產(chǎn)維生素C的主要方法。是目前世界各國生產(chǎn)維生素C普遍采用的路線。羅氏公司也因此獨占了維生素C的市場。

萊氏法制備維生素C合成路線L-山梨糖目前國外幾家主要的生產(chǎn)VC的公司都采用此方法。優(yōu)點工藝成熟、產(chǎn)品質(zhì)量好生產(chǎn)周期短，總收率高（66%）缺點工序多，耗用原料多有易燃易爆有機溶劑對勞動保護和安全生產(chǎn)要求高本法以微生物氧化代替化學(xué)氧化，簡化原有的萊氏法生產(chǎn)工序。是中國的創(chuàng)新技術(shù)。1980，是中國第一個擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的工藝技術(shù)。大幅改進了Reichstein的一步發(fā)酵法，減低維生素C的生產(chǎn)成本。此法先將葡萄糖還原成為山梨醇，經(jīng)過第一次細菌發(fā)酵成為山梨糖，再經(jīng)過第二次細菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化為KGA（2-keto-gulonicacid），最后異化成為維生素C。這項專利的國際使用權(quán)于1985年出售給瑞士羅氏公司，是當時中國對外技術(shù)轉(zhuǎn)讓中最大的項目。羅氏得到了專利但是并不使用，仍然沿用舊有的Reichstein的一步發(fā)酵法。它的目的是要防止其它外國公司使用新法與其競爭。這項專利在中國的國內(nèi)使用權(quán)并沒有賣斷給羅氏公司，到了1990初期中國國內(nèi)成立了26家藥廠用二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C。

二、兩步發(fā)酵法--簡化縮短的萊氏法L-山梨糖優(yōu)點縮短工序降低了原料成本節(jié)約了大量有機溶劑，減少了“三廢”多數(shù)是液體物料，有利于機械化和自動化生產(chǎn)缺點總收率較低（45-48%）發(fā)酵單位體積產(chǎn)率低（60mg/100mL）設(shè)備體積大，能耗大目前維生素C的工業(yè)生產(chǎn)不論是Reichstein-Grussner發(fā)明的“萊氏合成法”，還是我國提出的“二步發(fā)酵法”，都是以D-葡萄糖高壓加氫轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的山梨醇為原料，生產(chǎn)維生素C前體一2-酮基-L-古龍酸。由于需要先將葡萄糖高壓加氫制備，給大規(guī)模生產(chǎn)帶來障礙。如能直接從葡萄糖開始發(fā)酵和制備Vc，就可避免上述問題，帶來巨大經(jīng)濟效益。

三、全化學(xué)合成法三步全化學(xué)合成法目前僅見少量報導(dǎo)，尚未發(fā)現(xiàn)投入生產(chǎn)。其合成路線是將葡萄糖或葡萄糖醛酸內(nèi)酯丙酮化后，經(jīng)催化、氧化，然后水解還原成維C。1、單酮葡萄糖法以葡萄糖為原料的全合成法據(jù)報道氧化一步收率70%，還原一步收率40%--50%,，優(yōu)點是從葡萄糖起僅三步反應(yīng)，簡化了工藝，縮短了周期，是目前已知的工藝路線中最短的。缺點是丙酮用量大，且須要耗用價值昂貴的鈉硼氫和氧化鉑，如能找到其他工藝方便成本低廉的還原方法，則更為理想。2、葡萄糖醛酸內(nèi)酯法以葡萄糖醛酸內(nèi)酯為原料，三步合成維生素C。日本1974年發(fā)表。收率比單酮葡萄糖法有所提高，且避免了用鉑，有其優(yōu)越性，且為維生素C用化學(xué)合成法創(chuàng)一新路，值得進一步探索。四、其他方法1、2-5-二酮基-D-葡萄糖酸法以葡萄糖為原料的兩步發(fā)酵法（新兩步發(fā)酵法）此法總轉(zhuǎn)化率很高，可達84.6%。雖然研究很成功，但未見工業(yè)化研究的報道。但是為進一步開展基因工程菌法（一步發(fā)酵法）奠定了基礎(chǔ)。2、基因工程菌法（一步發(fā)酵法）用構(gòu)建的基因工程菌使歐文氏菌屬和棒狀桿菌屬兩種菌彼此相關(guān)的特性結(jié)合到一株菌中，直接從葡萄糖只需一步發(fā)酵便可生產(chǎn)2-酮基-L古龍酸。但此法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)收率較低，尚無進一步報道。第三節(jié)生產(chǎn)工藝原理和過程一、萊氏法生產(chǎn)維生素C的工藝原理和過程L-山梨糖D-山梨醇的制備L-山梨糖的制備2,3,4,6-雙酮基-L-山梨糖（雙丙酮糖）的制備2,3,4,6-雙酮基-L-古龍酸（雙丙酮古龍酸）的制備粗品維生素C的制備粗品維生素C的精制1、D-山梨醇的制備(1)工藝原理

D-山梨醇是己六醇化合物，含有4個手性碳原子，具有D-葡萄糖的構(gòu)型，故可將D-葡萄糖上的C-1上的醛基還原成醇基而制得。但是D-葡萄糖在受熱，或與堿、吡啶作用后，端基C-2的手性碳原子的構(gòu)型可以發(fā)生差向異構(gòu)化而形成D-甘露糖，再還原而得D-甘露醇。因此反應(yīng)產(chǎn)物是D-山梨醇和D-甘露醇的混合物，要控制甘露醇的量。工業(yè)生產(chǎn)中都是采用D-葡萄糖催化氫化的方法制備D-山梨醇?？刂茐毫Α渥鬟€原劑、鎳作催化劑3.8-4.0MPa（2）工藝過程在70-75℃下加水溶解葡萄糖，50%溶液加活性炭攪拌，濾去碳渣，用石灰乳液調(diào)節(jié)pH8.4氫氣純度≥99.3%、壓強<0.04MPa時，將糖液沖入釜內(nèi)加入活性鎳催化劑通蒸汽，并攪拌溫度升至120-135℃時關(guān)閉蒸汽控制溫度在150-155℃，壓強3.8-4.0MPa反應(yīng)至不吸收氫氣為反應(yīng)終點0.2-0.3MPa壓強下壓料至沉淀缸、過濾、樹脂交換、活性炭處理減壓濃縮，得到含量60-70%的D-山梨醇，無色透明或微黃色透明粘稠液體，收率約95%1、D-山梨醇的制備（3）反應(yīng)條件及影響因素pH值葡萄糖水溶液pH8.0-8.5偏高或偏低會使甘露醇（副產(chǎn)物）含量增加如果pH過高或過低，將會使甘露醇的含量增加，尤其是pH>10時，甘露醇含量直線上升。在規(guī)定的pH范圍內(nèi)如果使用催化劑活性良好，則所得山梨醇中甘露醇含量極低。設(shè)備材質(zhì)山梨醇能溶解多種金屬避免使用鐵、鋁或銅制設(shè)備，而用不銹鋼副產(chǎn)物影響（比旋度控制在+5.50o）甘露醇影響產(chǎn)物比旋度純山梨醇的比旋度為-2.0°，純甘露醇為-0.49°。實際測定時，加入硼砂，使其分別與山梨醇和甘露醇形成了絡(luò)合物，前者比旋度為+4.0°，后者比旋度為+23.4°。根據(jù)測定的比旋度可以計算所含甘露醇的量。氫化速度快，反應(yīng)時間短，可以減少甘露醇的生成量。殘?zhí)呛坑绊懏a(chǎn)物比旋度——氫化反應(yīng)的終點指標葡萄糖（比旋度為+53°）的存在對比旋度的影響比甘露醇大2倍，因此氫化反應(yīng)必須完全，盡可能減少殘?zhí)橇浚ㄟ€原糖）。殘?zhí)呛考仁菤浠K點指標。1、D-山梨醇的制備（4）注意事項及三廢處理車間進行還原反應(yīng)時氫氣自制，故配有氫氣柜。應(yīng)杜絕火源，以免氫氣發(fā)生爆炸廢鎳催化劑可壓制成塊，冶煉回收再生廢液中的鎳經(jīng)沉淀后可回收廢酸、廢堿經(jīng)中和后放入下水道萊氏法生產(chǎn)維生素C的工藝原理和過程復(fù)習(xí)L-山梨糖NaClONiSO4.7H2O2、L-山梨糖的制備（1）工藝原理選擇性地使C2位的羥基氧化成羰基生物氧化黑醋菌作為生物氧化劑*發(fā)酵制藥概念利用制藥微生物的生長繁殖，通過發(fā)酵，代謝合成藥物，然后從中分離提取、精制純化，獲得藥品的過程發(fā)酵制藥的基本過程菌種選育發(fā)酵工段提煉工段成品工段孢子制備種子制備發(fā)酵控制預(yù)處理分離提取濃縮純化成品工段包裝原料藥實驗室、種子庫發(fā)酵車間提煉車間包裝車間2、L-山梨糖的制備（2）工藝過程菌種部分--菌種是發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵！試驗得到黑醋菌為D-山梨醇最有效的生物氧化劑黑醋菌是一種小短桿菌，屬革蘭氏陰性菌（G-），生長溫度為30~36℃，最適溫度為30~33℃。向菌種保藏機構(gòu)索取有關(guān)的菌株。菌種來源的途徑中國典型培養(yǎng)物保藏中心:ChinaCenterforTypeCultureCollection(CCTCC)。中國普通微生物菌種保藏管理中心：ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter(CGMCC)，微生物所（真菌和細菌）；武漢所（病毒）抗生素菌種保藏管理中心（CACC）：2.

從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株。容易篩選到較理想的菌株。

3.

由自然界采集樣品中獲得。如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選。容易發(fā)現(xiàn)新的菌株資源。菌種保藏菌種經(jīng)過多次傳代，會發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致退化，從而喪失生產(chǎn)能力甚至菌株死亡。目的：保持菌種原有優(yōu)良特性，延長生命時限，長期存活、不退化。原理：使菌種代謝處于不活躍狀態(tài)，即生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。措施：物理和化學(xué)方法（溫度：低溫；水分：干燥；氧氣：缺氧；營養(yǎng)：缺乏）菌種保存方法菌株分離與篩選菌株分離(separation)：是將樣品（如土壤、海洋、堆肥等）中混雜生長的各種微生物通過分離技術(shù)區(qū)分開，獲得所需微生物的過程。菌株篩選(screening)：在目的菌株分離的基礎(chǔ)上，結(jié)合常規(guī)生產(chǎn)性能測定，選擇目的產(chǎn)物合成能力相對高的菌株的過程。稀釋涂布法菌種選育——自然選育（1）不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自然突變而進行的菌種篩選過程。（1）菌種的提純復(fù)壯。（2）防止退化，穩(wěn)定生產(chǎn)水平。1年1次。

過程菌種單孢子平板分離單菌落測活優(yōu)良菌株效率低,增產(chǎn)幅度小菌種選育——誘變育種（2）人為創(chuàng)造條件（誘變劑處理），使菌種發(fā)生變異，篩選優(yōu)良個體，淘汰劣質(zhì)個體。物理類：紫外線，快中子，激光，太空射線?；瘜W(xué)類：堿基類似物，嵌合劑，亞硝酸。生物類：噬菌體，轉(zhuǎn)座子。特點：快速，簡單，效益大。缺點：無定向性。菌種選育——雜交育種（3）兩個不同基因型的菌株，通過結(jié)合或原生質(zhì)體融合，使遺傳物質(zhì)發(fā)生重新組合，從中分離篩選出具有優(yōu)良性狀的新菌株。

特點：有一定的定向性。將黑醋菌保存于斜面培養(yǎng)基中，每月活化傳代一次，保存于0~5℃冰箱內(nèi)。斜面培養(yǎng)基中菌種活化傳代24h后，產(chǎn)糖量達到100mg/mL。劃試管斜面在30℃培養(yǎng)48h，鏡檢菌體正常、無雜菌，即可接入生產(chǎn)。菌種活化菌種復(fù)蘇方法從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，應(yīng)立即放置38℃-40℃水浴中快速復(fù)蘇并適當快速搖動。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。菌株活化：在無菌操作下用無菌微量吸管，從已溶解的菌液，滴入固態(tài)指定培養(yǎng)基，以劃線法接種于培養(yǎng)基。將接種好的培養(yǎng)基置于指定溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑選培養(yǎng)基茁壯的菌落接種到新的培養(yǎng)基培養(yǎng)，重復(fù)2-3次。種子擴大培養(yǎng)發(fā)酵部分投料。D-山梨醇濃度為16%-20%培養(yǎng)基（酵母膏、碳酸鈣、瓊脂、磷酸鹽、硫酸鹽等）控制pH5.4-5.6，120℃滅菌0.5h通入無菌空氣在發(fā)酵罐中培養(yǎng)（溫度30-32℃；壓力0.03-0.05MPa）一級種子罐發(fā)酵率40%以上，二級種子罐發(fā)酵率50%以上發(fā)酵培養(yǎng)基制備概念供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。培養(yǎng)基的成分碳源氮源無機鹽水生長因子前體與促進劑消泡劑1、碳源(carbonsources)概念：構(gòu)成微生物細胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營養(yǎng)物質(zhì)。作用：為正常生理活動和過程提供能量來源，為細胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的合成提供碳骨架。碳源種類糖類：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油和豬油醇類：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白類：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖類、有機酸遲效碳源：酪蛋白水解產(chǎn)生的脂肪酸2、氮源（nitrogensources）概念：構(gòu)成微生物細胞和代謝產(chǎn)物中氮素的營養(yǎng)物質(zhì)。作用：為生長和代謝主要提供氮素來源。種類：無機氮源、有機氮源有機氮源幾乎所有微生物都能利用有機氮源：黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、尿素。無機氮源氨水、銨鹽和硝酸鹽等。氨鹽比硝酸鹽更快被利用。工業(yè)應(yīng)用：主要氮源或輔助氮源；調(diào)節(jié)pH值生理酸性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生酸性殘留物質(zhì)。（NH4）2SO4利用后，產(chǎn)生硫酸生理堿性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生堿性殘留物質(zhì)。硝酸鈉利用后，產(chǎn)生氫氧化鈉。3、無機鹽和微量元素概念：組成生理活性物質(zhì)或具有生理調(diào)節(jié)作用礦物質(zhì)作用方式：低濃度起促進作用，高濃度起抑制作用。種類：鹽離子磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣，常常添加鐵、鋅、銅、鉬、鈷、錳、氯，一般不加。4、水菌體細胞的主要成分。營養(yǎng)傳遞的介質(zhì)。良好導(dǎo)體，調(diào)節(jié)細胞生長環(huán)境溫度。培養(yǎng)基的主要成分之一。5、生長因子（growthfactor）概念：維持微生物生長所必需的微量有機物，不起碳源和氮源作用。種類：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般無需添加。營養(yǎng)缺陷型菌株：必需添加。6、前體(precursor)概念：加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，被直接結(jié)合到目標產(chǎn)物分子中，而自身的結(jié)構(gòu)無多大的變化。使用：添加前體是提高抗生素產(chǎn)量的重要措施。多次少量、連續(xù)流加的工藝。7、促進劑(accelerant)概念：促進產(chǎn)物生成的物質(zhì)，但不是營養(yǎng)物，也不是前體的一類化合物。種類：氯化物有利于灰黃霉素、金霉素合成。表面活性劑吐溫、清洗劑，脂溶性小分子化合物等，起誘導(dǎo)作用。8、消沫劑（defoamingagent）概念：降低泡沫的液膜強度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。種類：表面活性劑，低表面張力。天然動植物油脂類、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類、聚醚類、硅酮類）。作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。培養(yǎng)基滅菌的操作方式(1)分批滅菌操作，間歇滅菌,實罐滅菌：配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，達到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。特點：不需其他的附屬設(shè)備，操作簡便，手動。缺點：加熱和冷卻時間較長。營養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。分批操作的滅菌過程分批滅菌的操作過程通入蒸汽：空氣管、夾套通入蒸汽。加熱升溫：70℃，取樣管、放料管通入蒸汽。維持保溫：120℃，罐壓0.1MPa，排氣。調(diào)節(jié)進汽和排氣量，維持30min。冷卻降溫：依次關(guān)閉排氣、進汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。（2）連續(xù)滅菌操作高溫短時滅菌操作，連續(xù)：培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過程。加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個階段由不同的設(shè)備執(zhí)行：加熱器，保溫設(shè)備，冷卻器。（2）連續(xù)滅菌操作－流程圖

培養(yǎng)基與高壓蒸汽直接混勻，達到滅菌溫度（130－140℃）（2）連續(xù)滅菌－操作過程配料：配料罐，配制培養(yǎng)基。預(yù)熱罐：定容和預(yù)加熱。70－90℃。加熱器：培養(yǎng)基與蒸汽混合，快速升到130－140℃。維持罐：維持滅菌時間,5－7分鐘。冷卻管：培養(yǎng)基經(jīng)過冷卻水管冷卻。40－50℃。輸入滅菌的發(fā)酵罐中。連續(xù)滅菌的特點1）高溫快速滅菌工藝，營養(yǎng)成分破壞的少2）熱能利用合理，易于自動化控制；3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌；4）增加了連續(xù)滅菌設(shè)備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。5）對壓力要求高，一般為0.45-0.8MPa?？諝獬僮鞴に嚢l(fā)酵對空氣的要求好氧微生物需要氧氣供應(yīng)，通入空氣。連續(xù)一定流量的壓縮無菌空氣。壓強：0.2-0.4MPa?？諝赓|(zhì)量：相對濕度小于70％；比培養(yǎng)溫度高10－30℃；潔凈度A級。工業(yè)制備大量空氣的方法加熱滅菌：空氣在進入培養(yǎng)系統(tǒng)之前，一般需用空壓機以提高壓力，所以空氣熱滅菌時所需溫度的提高，可直接利用空氣壓縮時的溫度升高來實現(xiàn).靜電除菌：靜電除塵是利用靜電引力來吸附帶電離子而達到除塵滅菌的目的。懸浮于空氣中的微生物、微生物孢子大多數(shù)帶有不同的電荷，沒有電荷的微粒進入高壓靜電場時則會被電離成帶電微粒，但對于一些直徑很小的微粒，它所帶的電荷很小，當產(chǎn)生的引力等于或小于氣流對微粒的拖帶力或微粒布朗運動的動量時，微粒就不能被吸附而沉降，所以靜電除塵對很小的微粒效率較低。介質(zhì)過濾：是使空氣通過經(jīng)高溫滅菌的介質(zhì)過濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質(zhì)層中，而達到除菌的目的。發(fā)酵部分發(fā)酵培養(yǎng)的山梨醇的投料濃度為25%當發(fā)酵率在95%以上時，溫度略高（31-33℃）；pH7.2左右，即為發(fā)酵終點控制真空度在0.05MPa以上，溫度60℃以下，減壓濃縮結(jié)晶即得L-山梨糖發(fā)酵罐-用于培養(yǎng)微生物或細胞的封閉容器或生物反應(yīng)裝置。

2、L-山梨糖的制備（3）反應(yīng)條件及影響因素①山梨醇的純度和殘?zhí)橇坑绊懷趸章省Ｉ嚼娲技兌仍礁?，殘?zhí)橇吭叫。章试礁?。②氧化速率與山梨醇濃度有關(guān)。山梨醇濃度不能過高和過低。③金屬離子的存在抑制細胞活性。因此要控制發(fā)酵液中金屬離子的濃度，另外不銹鋼材質(zhì)的設(shè)備。④適當加生物氧化劑，可提高發(fā)酵率。⑤空氣流量控制在一定范圍（0.7-1VVM）。一般越大越好，但是過大，動力消耗太大，對設(shè)備的要求嚴格。⑥細菌的接種量對氧化速率有顯著影響。接種量較大時，可顯著提高提高發(fā)酵率。2、L-山梨糖的制備（4）注意事項盡量減少染菌途徑其途徑有種子或發(fā)酵罐帶菌接種時罐壓低于大氣壓培養(yǎng)基消毒不徹底操作中染菌閥門泄露空氣分布管腐蝕，易造成死角：管道內(nèi)結(jié)垢，易消不透染菌3、雙丙酮糖的制備（1）工藝原理通過丙酮酮化保護保護2位酮基，3，4，5位羥基不被氧化。（2）工藝過程配料比L-山梨糖：丙酮：發(fā)煙硫酸：氫氧化鈉=1:9:0.4:0.6步驟5℃下壓入丙酮、發(fā)煙硫酸，加入山梨糖15-20℃下溶糖6h降溫至-8℃，保持6-7h得酮化液。<25℃，加入18%-22%的氫氧化鈉溶液，中和至pH8.0-8.5下層硫酸鈉用丙酮洗滌，回收單丙酮糖上層清液常壓蒸餾至100℃，減壓蒸餾至90℃為終點苯提取蒸餾后剩余溶液，減壓蒸餾得雙丙酮糖收率88%（3）反應(yīng)條件及影響因素縮酮化反應(yīng)有多種副產(chǎn)物-溫度高、水分多、時間過長、硫酸過多則副反應(yīng)增多，雙酮糖收率降低酮化反應(yīng)溫度—低溫-低于20℃-高于20℃將有利于單酮糖的生產(chǎn)，收率降低酸度--堿性-中和至pH為8.0-8.5，雙酮糖在酸性條件下不穩(wěn)定。3、2,3,4,6-雙酮基-L-山梨糖的制備（4）注意事項雙酮糖在酸性中不穩(wěn)定，堿性中較溫定。因此中和時，必須保持堿性和低溫條件3、2,3,4,6-雙酮基-L-山梨糖的制備4、雙丙酮古龍酸的制備（1）工藝原理氧化劑---NaClO催化劑---NiSO47H2O（2）工藝過程次氯酸鈉的制造——新鮮配制反應(yīng)釜內(nèi)加入14.5%-15.5%的氫氧化鈉溶液，通入液氯，攪拌（轉(zhuǎn)速不宜過高）以有效氯濃度9.5-9.7%，余堿濃度2.8-3.2%為終點雙丙酮酸的氧化配料比雙丙酮糖：次氯酸鈉：硫酸鎳=1：10：0.04投料，40℃保溫攪拌30min靜止片刻，抽濾濾液冷至0-5℃，用鹽酸中和（pH7、3、1.5）過濾、水洗、過濾。得結(jié)晶，收率86%。（1）工藝原理5、粗品維生素C的制備-酸轉(zhuǎn)化2-酮基-L-古龍酸（2-KGA）（2）工藝過程配料比2-酮基-L-古龍酸：38％鹽酸：丙酮＝1：0.4(W／V)：0.3(W／V)先將丙酮和一半古龍酸加入轉(zhuǎn)化罐，攪拌再加入鹽酸和余下的古龍酸蒸汽加熱，升溫至30-38℃，關(guān)閉蒸汽，自然升溫至52-54℃，保溫5h達到反應(yīng)高潮，保持溫度50-52℃，至總反應(yīng)時間20h，冷卻過濾、冷乙醇洗滌，得維生素C粗品，收率88%③轉(zhuǎn)化

（3）反應(yīng)條件及影響因素鹽酸濃度38%若鹽酸濃度偏低，則轉(zhuǎn)化不完全，收率低若鹽酸濃度偏高，則分解成許多雜質(zhì)，使反應(yīng)物顏色較深丙酮的影響酸性條件下，產(chǎn)物容易分解為糠醛，進一步聚合成水和醇不溶的糠醛樹脂。加入丙酮可以溶解糠醛，降低其活性而阻止其聚合加料的先后順序先加丙酮，使之與雙丙酮古龍酸形成一種懸浮液，易攪拌。析出溫度的影響析出溫度555656.5575859析出溫差122.5345收率%74.882.382.7828180.5析出期為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的劇烈期析出期溫差太小，為1℃，說明反應(yīng)不劇烈，放熱小，不完全溫差太大，為5℃，則反應(yīng)放熱太多，反應(yīng)太劇烈，熱量不能很快傳遞出去，加速副反應(yīng)發(fā)生，嚴重時會引起燒料最佳溫差2.5℃，析出溫度不能高于59℃如遇突然停電，應(yīng)選關(guān)蒸汽，后關(guān)攪拌來電后，先開攪拌，后開蒸汽，緩慢升溫6、粗品維生素C的精制配料比粗維生素C(折純)：蒸餾水：活性炭：乙醇=1：1.1:0.06:0.6步驟粗品（85%）真空干燥（50-55℃，20-30min）除去揮發(fā)性雜質(zhì)（鹽酸、丙酮）投入熱水（68-70℃）中溶解加入活性炭攪拌5-10min保溫壓濾結(jié)晶罐中降溫至45-50℃6、粗品維生素C的精制加入晶種，緩慢冷卻至-2℃，結(jié)晶晶體離心甩濾，冰乙醇洗滌甩濾，低溫干燥（43-45℃，1.5h）得精制維生素C（m.p.190-192℃）收率91%總收率60%（對D-山梨醇計）萊氏法生產(chǎn)維生素C的工藝原理和過程復(fù)習(xí)L-山梨糖NaClONiSO4.7H2O二、兩步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C的工藝原理及過程D-山梨醇的制備2-酮基-L-古龍酸的制備（兩步發(fā)酵）L-山梨糖的制備（第一步發(fā)酵）2-酮基-L-古龍酸的制備（第二步發(fā)酵）粗維生素的制備維生素C的精制L-山梨糖3、2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)的制備（1）工藝原理微生物氧化法---氧化葡萄糖酸桿菌(小菌)-假單胞桿菌或芽孢桿菌(大菌)作為生物氧化劑提取---離子交換法假單胞菌

芽孢桿菌1）實驗室菌種制備將保存于冷凍管的假單孢桿菌和氧化葡萄糖酸桿菌菌種活化，分離及混合培養(yǎng)后移入三角瓶種液培養(yǎng)基中，在29-33℃振蕩培養(yǎng)24h，產(chǎn)酸量在6-9mg/ml，pH值降至7以下，菌形正常無雜菌，再移入血清瓶中，即可接入生產(chǎn)。（2）工藝過程2、種子培養(yǎng)液制備先在一級種子培養(yǎng)罐內(nèi)加入經(jīng)過滅菌后的輔料（培養(yǎng)基：玉米漿、尿素及無機鹽）和醪液（折純含山梨糖1%）；控制溫度為29-30℃，發(fā)酵初期溫度較低，通入無菌空氣維持罐壓為0.05MPa，pH6.7-7.0，至產(chǎn)酸量達合格濃度，且不再增加時，接入二級種子罐培養(yǎng)，條件控制同前；作為伴生菌的芽孢桿菌開始形成芽孢時，產(chǎn)酸菌株開始產(chǎn)生2-酮基-L-古龍酸，直到完全形成芽孢和出現(xiàn)游離芽孢時，產(chǎn)酸量達高峰（5mg/ml以上）為二級種子培養(yǎng)終點。3、發(fā)酵罐發(fā)酵供發(fā)酵罐用的培養(yǎng)基經(jīng)滅菌冷卻后，加入至山梨糖的發(fā)酵液內(nèi)，接入第二步發(fā)酵菌種的二級種子培養(yǎng)液，在溫度30℃，通入無菌空氣下進行發(fā)酵；為保證產(chǎn)酸正常進行，往往定期滴加滅菌的碳酸鈉溶液調(diào)pH值，使保持7.0左右。當溫度略高（31-33℃），pH在7.2左右、二次檢測酸量不再增加，殘?zhí)橇?.5mg/ml以下，即為發(fā)酵終點，得含古龍酸鈉的發(fā)酵液。此時游離芽孢及殘存芽孢桿菌菌體已逐步自溶成碎片，用顯微鏡觀察已無法區(qū)分兩種細菌的差別，整個產(chǎn)酸反應(yīng)到此也就結(jié)束了。所以，根據(jù)芽孢的形成時間來控制發(fā)酵是一種有效的辦法。在整個發(fā)酵期間，保持一定數(shù)量的氧化葡萄糖酸桿菌（產(chǎn)酸菌）是發(fā)酵的關(guān)鍵。

影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素主要有以下幾點：①山梨糖初始濃度在一定的溫度（30℃）、壓力（表壓0.05Mpa）和pH（6.7~7.0）和溶液氧濃度（10%~60%）下存在一個極限濃度，此極限濃度為80mg/ml。當山梨糖濃度大于該濃度時，將抑制菌體生長，表現(xiàn)為產(chǎn)酸前期長，產(chǎn)酸速率變小，使發(fā)酵產(chǎn)率下降。從生產(chǎn)角度考慮，希望得到盡可能高的酸濃度，也即要求山梨糖初始濃度越高越好。因此，較適宜的初始濃度為80mg/ml左右。在產(chǎn)酸中期，菌體生長正常時，高濃度的山梨糖對發(fā)酵收率影響不大。因此，在發(fā)酵過程中滴加山梨糖或一次補加山梨糖均能提高發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度。②溶氧濃度在發(fā)酵過程中，溶氧不但是菌體生長所必需的條件，而且又是反應(yīng)物之一。在菌體生長階段，高溶氧能使菌體很好地生長，而在中期，則應(yīng)控制一定的溶氧濃度以限制菌體的過度生長，避免過早衰老，從而延長菌體的生產(chǎn)期。中期溶氧濃度越高，產(chǎn)酸速率越大，但產(chǎn)酸中期越短，這對整個發(fā)酵過程是不利的。因此，生產(chǎn)上一般前期處于高的溶氧狀態(tài)；中期溶氧以3.5-6.0mg/ml為宜；后期耗氧減少，大多數(shù)情況下溶氧濃度會上升。③pH值發(fā)酵過程中如pH降至6.4是不利的，如能通過連續(xù)的調(diào)節(jié)使pH維持于6.7-7.9間對發(fā)酵是有利的。.3、提取部分一次交換鹽酸酸化，調(diào)菌體蛋白等電點，沉降4h以上上清液以2-3m3/h的流速壓入陽離子交換柱當流出液pH為3.5時，收集交換液，控制pH交換完，純水沖柱蛋白質(zhì)和氨基酸一樣都是兩性電解質(zhì)。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH值，可使蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈或末端攜帶不同的電荷；在某一pH時其分子中的正電荷與負電荷數(shù)目相等，即凈電荷為零，該pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點。在等電點時蛋白質(zhì)的溶解度往往較低容易沉淀析出。加熱過濾合并流出液和洗液調(diào)pH至蛋白等電點加熱至70℃，加0.3%活性炭升溫至90-95℃，保溫10-15min，使蛋白凝結(jié)停止攪拌，快速冷卻，高速離心二次交換上清液打入二次交換柱洗脫，至流出液pH=1.5時，收集交換液控制pH1.5-1.7之間。交換完畢，洗柱減壓濃縮二次交換液進行一級濃縮控制真空度、內(nèi)溫，至濃縮液的相對密度達1.2出料同樣條件二次濃縮，至盡量干加少量乙醇，冷卻結(jié)晶甩濾，冰乙醇洗滌得2-酮基-L-古龍酸（m.p.158-162℃）收率80%②提取

三、維生素C粗品的制備（③轉(zhuǎn)化）由2-酮基-L-古龍酸轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸需經(jīng)過轉(zhuǎn)化，因使用催化劑的不同，可以分為酸轉(zhuǎn)化、堿轉(zhuǎn)化、酶轉(zhuǎn)化。1、酸轉(zhuǎn)化（萊氏法）2、堿轉(zhuǎn)化（1）工藝原理+Na2SO4（2）工藝過程①