藥品微生物驗(yàn)證實(shí)例課件

微生物限度檢查法

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及實(shí)例微生物限度檢查法

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及實(shí)例1標(biāo)準(zhǔn)化操作方法選擇樣品處理沖洗方法和條件中和劑加入菌液加入標(biāo)準(zhǔn)化操作2標(biāo)準(zhǔn)化操作沖洗方法

強(qiáng)調(diào)少量多次：50ml/次；強(qiáng)調(diào)充分振搖；操作細(xì)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，如集菌儀轉(zhuǎn)速、沖洗過程中蓋還是不蓋濾筒下口等等。

標(biāo)準(zhǔn)化操作沖洗方法3標(biāo)準(zhǔn)化操作中和劑加入

不同中和劑加入方式可能效果不一樣。通過我們的經(jīng)驗(yàn)，基本傾向于直接加入培養(yǎng)基中效果最好。但如果某些中和劑對(duì)微生物生長(zhǎng)不利可考慮其他步驟加入。標(biāo)準(zhǔn)化操作中和劑加入4標(biāo)準(zhǔn)化操作菌液加入按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，主要是考慮濾器的有效性。濾器的有效性應(yīng)由提供企業(yè)控制，用戶可采用適當(dāng)方法抽查（如檢查陽性菌液通過濾筒的流出液）。標(biāo)準(zhǔn)化操作菌液加入5標(biāo)準(zhǔn)化操作菌液加入

而驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質(zhì)對(duì)陽性菌生長(zhǎng)的影響，可以與對(duì)照濾筒比較而做出判斷，所以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中加菌時(shí)機(jī)與方式只要與對(duì)照一致即可。標(biāo)準(zhǔn)化操作菌液加入6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的幾個(gè)問題微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的幾個(gè)問題7微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)樣品菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液（同無菌檢查）回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)控制菌檢查的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)器材微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)樣品8首先應(yīng)是合格的樣品。微生物限度檢查樣品首先應(yīng)是合格的樣品。微生物限度檢查樣品9微生物限度檢查樣品樣品給藥途徑和類型決定何種控制菌檢查驗(yàn)證

一般口服制劑驗(yàn)證大腸埃希菌

外用制劑驗(yàn)證金葡和銅綠假單胞含藥材原粉；含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑的大腸菌群檢查驗(yàn)證含動(dòng)物組織（包括提取物）口服制劑驗(yàn)證沙門菌陰道給藥制劑（中成藥）驗(yàn)證梭菌微生物限度檢查樣品樣品給藥途徑和類型決定何種控制菌檢查驗(yàn)證10抽樣量和檢驗(yàn)量分別單列一項(xiàng)。抽樣量一般抽樣量為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝）的3倍。檢驗(yàn)量指供試品一次檢驗(yàn)的用量。一般為10g或10ml；化學(xué)藥膜劑為100cm2；貴重或微量包裝的藥品可酌減（不得少于3g）。檢查沙門菌的供試品其檢驗(yàn)量改為10g或10ml。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按檢驗(yàn)量執(zhí)行。

微生物限度檢查樣品抽樣量和檢驗(yàn)量分別單列一項(xiàng)。微生物限度檢查樣品11微生物限度檢查樣品制劑形式多樣，決定前處理各異

難溶固體制劑非水溶性制劑軟膏、油膏栓劑等微生物限度檢查樣品制劑形式多樣，決定前處理各異12供試液的制備制備供試液所用的乳化劑、分散劑、中和劑及其用量應(yīng)驗(yàn)證，在該檢驗(yàn)條件無抗菌作用。

7類供試品供試液的制備，其中增訂：微生物限度檢查樣品前處理供試液的制備制備供試液所用的乳化劑、分散劑、中和劑及其用13非水溶性供試品

①司盤80、單硬脂酸甘油酯、聚山梨酯80

②供試品10g，20ml無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠，必要時(shí)再加適量十四烷酸異丙酯，充分振搖，使供試品溶解。然后加

45℃100mlpH7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液，振搖5-10分鐘，萃取，待油水分層后，取水層作為1：10供試液。微生物限度檢查樣品前處理非水溶性供試品微生物限度檢查樣品前處理14

非水溶性膜劑供試品

化學(xué)藥膜劑取100cm2，剪碎，加100mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，浸泡，振搖，作供試液。一部中藥膜劑取50cm2，剪碎，加適量的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液（50或100ml）浸泡，振搖，以供試品浸液為供試液。（SOP2000版規(guī)定:中藥膜劑取30-50cm2，剪碎，加水100ml）。微生物限度檢查樣品前處理非水溶性膜劑供試品微生物限度檢查樣品前處理15腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品10g，加100mlpH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（腸溶制劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（結(jié)腸制劑）,于45℃水浴振搖，使溶解。

微生物限度檢查樣品前處理腸溶及結(jié)腸溶制劑微生物限度檢查樣品前處理16氣霧劑、噴霧劑供試品

取規(guī)定量供試品，置冷凍室冷凍1h，取出，迅速消毒供試品開啟部位周圍，用無菌鋼錐鉆一小孔，放置室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑全部拋出。以無菌注射器吸出全部藥液，按標(biāo)示量加稀釋劑至足量（若含非水溶性成份，加適量無菌聚山梨酯-80液），使勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1∶10的供試液。微生物限度檢查樣品前處理氣霧劑、噴霧劑供試品微生物限度檢查樣品前處理17具抑菌活性的供試品供試品接種至較大量的培養(yǎng)基中。1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿；控制菌檢查，可加大增菌培養(yǎng)基的用量，或采用薄膜過濾法。

離心集菌法

薄膜過濾法

微生物限度檢查樣品前處理具抑菌活性的供試品微生物限度檢查樣品前處理18微生物限度檢查樣品前處理目標(biāo)是使不便于取樣的供試品分散均勻！微生物限度檢查樣品前處理19微生物限度檢查法驗(yàn)證細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

定量——回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)控制菌檢查方法驗(yàn)證定性——能否生長(zhǎng)、專屬性實(shí)驗(yàn)微生物限度檢查法驗(yàn)證細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證20

在建立供試品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法或原法的檢驗(yàn)條件有改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)對(duì)檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)做規(guī)定菌的回收試驗(yàn)，以判斷供試品是否具有抗菌活性的實(shí)驗(yàn)方法。

回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)在建立供試品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法或原法的檢驗(yàn)條件21驗(yàn)證用菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念株菌、黑曲霉。菌液制備（同無菌檢查法）。取培養(yǎng)物用無菌氯化鈉溶液稀釋成1ml含50～100cfu的菌液?；厥章蕼y(cè)定實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證用菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念株22驗(yàn)證方法

試驗(yàn)組取規(guī)定量最低稀釋級(jí)的供試液，加入50～100cfu的菌液，按平板菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)或薄膜過濾計(jì)數(shù)。菌液組測(cè)定加入的試驗(yàn)菌液的菌數(shù)。供試品對(duì)照組測(cè)定供試品稀釋液（本底）的菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組取稀釋液加入50～100cfu的菌液，按供試品組供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。

驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)獨(dú)立平行進(jìn)行3次，分別計(jì)算各次

試驗(yàn)菌的回收率。

回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)23

回收率計(jì)算

試驗(yàn)組的菌回收率=[（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)–供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)]×100%稀釋劑對(duì)照組的菌回收率=[（稀釋劑對(duì)照組的平均

菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)）]×100%

回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)回收率計(jì)算回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)24結(jié)果判斷

稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)大于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率均大于70%，符合驗(yàn)證試驗(yàn)，可按此方法測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次平行試驗(yàn)中供試品組的菌回收率均小于70%，不符合驗(yàn)證試驗(yàn)，應(yīng)建立新的檢驗(yàn)方法，并重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同

時(shí)進(jìn)行?；厥章蕼y(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)25回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)常規(guī)法（平皿法）薄膜過濾法回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)常規(guī)法（平皿法）26回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)常規(guī)法（平皿法）

在采用培養(yǎng)基稀釋法時(shí)，應(yīng)注意避

免在注皿前菌液和供試液直接接觸；回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)常規(guī)法（平皿法）27回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)常規(guī)法（平皿法）

稀釋法（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均應(yīng)加1ml菌液。培養(yǎng)基稀釋的表示：1:200；1:400；1:1000回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)常規(guī)法（平皿法）28回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)薄膜過濾法

菌液檢驗(yàn)（計(jì)數(shù)）應(yīng)與供試液同法處理，也要采用薄膜過濾法?；厥章蕼y(cè)定實(shí)驗(yàn)薄膜過濾法29

在建立供試品的控制菌檢查法或原法的檢驗(yàn)條件有改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)對(duì)檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)做規(guī)定菌的回收試驗(yàn)，以判斷供試品是否具有抗菌活性的實(shí)驗(yàn)方法。控制菌檢查方法驗(yàn)證在建立供試品的控制菌檢查法或原法的檢驗(yàn)條件有改變可能30驗(yàn)證用菌株：

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌。菌液制備（同前）：

用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1ml含10-100cfu。

控制菌檢查方法驗(yàn)證驗(yàn)證用菌株：控制菌檢查方法驗(yàn)證31驗(yàn)證方法①試驗(yàn)組：取規(guī)定量供試液及10～100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過濾法時(shí)，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，沖洗后，取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。②陰性菌對(duì)照組：設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的特異性。方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌；驗(yàn)證銅

綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照

菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì)照菌不得檢出?？刂凭鷻z查方法驗(yàn)證驗(yàn)證方法控制菌檢查方法驗(yàn)證32結(jié)果判定

陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消

除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。

驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的控制菌檢查同

時(shí)進(jìn)行。控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果判定控制菌檢查方法驗(yàn)證33控制菌檢查方法驗(yàn)證培養(yǎng)基稀釋法薄膜過濾法大腸菌群的半定量控制菌檢查方法驗(yàn)證培養(yǎng)基稀釋法34實(shí)驗(yàn)器材微生物限度檢查薄膜過濾器

經(jīng)過無數(shù)次實(shí)驗(yàn)，開發(fā)出了成熟的微生物限度檢查用薄膜濾器。安全、可靠、方便。采用75mm濾膜，菌落計(jì)數(shù)更清晰。無需轉(zhuǎn)膜，直接用于控制菌檢查。實(shí)驗(yàn)器材微生物限度檢查薄膜過濾器3575mm薄膜過濾器75mm薄膜過濾器3675mm薄膜過濾器75mm薄膜過濾器37驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的幾個(gè)問題微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的幾個(gè)問題38驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例潔身泡沫劑 供試液制備：取供試品，放置在-40℃低溫冰柜中冷凍1-2小時(shí)，瓶?jī)?nèi)液體凝固取出，在無菌條件下迅速開啟，將內(nèi)容物取出放入無菌的三角燒瓶?jī)?nèi)，等內(nèi)容物完全液化后，取供試液10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨

緩沖液至100ml，制成1:10的供試液。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例潔身泡沫劑39驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例氧氟沙星凝膠 供試液制備：取供試品10g，加無菌的5％氯化鈣溶液10ml充分混合均勻，再加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1:10的供試液備用。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例氧氟沙星凝膠 40驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例 復(fù)方醋酸地塞米松乳膏

供試液制備：取供試品10g，加45℃的無菌0.1％吐溫溶液至100ml，混勻，作為供試液。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例 復(fù)方醋酸地塞米松乳膏41驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例雙唑泰軟膠囊栓稱取樣品10g，加PH7.0氯化鈉-蛋白胨-聚山梨酯80的混和液100ml(水溫為40℃)至100ml，濃度為1：10供試液。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例雙唑泰軟膠囊栓42驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例離心集菌薄膜過濾法取離心管上清液1ml加入薄膜過濾器中,沖洗300ml/膜,另取1ml上述5種試驗(yàn)菌株，加入平皿中，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌加營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml，白色念珠菌和黑曲霉菌玫瑰紅鈉瓊脂20ml,待凝固后，再取膜貼于瓊脂平板,置規(guī)定溫度培養(yǎng)

24~72小時(shí)觀察結(jié)果，細(xì)菌計(jì)數(shù)，測(cè)

定回收率。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例離心集菌薄膜過濾法43驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例黃連上清片取供試品10g，置均質(zhì)器中充分混勻后加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1:10的供試液。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例黃連上清片44驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例

富馬酸酮替酚滴鼻液

控制菌需檢查大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例

富馬酸酮替酚滴鼻液

控制菌需檢查大腸埃45驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例西洛他唑緩釋片按藥典規(guī)定供試液應(yīng)為1：10但此緩釋片配成1：10供試液時(shí)，其粘稠度過大，不利于吸取供試液，所以將此類藥物配制成1：20供試液。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例西洛他唑緩釋片46驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例調(diào)補(bǔ)肺腎膠囊

此藥品中含有動(dòng)物組織控制菌需做沙門菌的檢查在驗(yàn)證試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)此藥品抑制沙門菌，用稀釋法10g加入到1000ml營養(yǎng)肉湯中，陽性菌才生長(zhǎng)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例調(diào)補(bǔ)肺腎膠囊47驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例

玉屏風(fēng)軟膠囊此藥品軟膠囊中的液體含有一定的油脂，配制1：10的供試液時(shí)油脂浮在水面上，不利于取樣，所以在配制供試液時(shí)，用45℃的無菌0.1%聚酸梨酯80溶液。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例

玉屏風(fēng)軟膠囊此藥品軟膠囊中的液體含有一定的48驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例供試品→供試液10ml(相當(dāng)于供試品1g、1ml)

↓80℃10min∣迅速冷卻|

↓

↓

100ml0.1%皰肉培養(yǎng)基