ISO4833-2023年菌落總數(shù)的檢測方法

ISOFDA食品微生物檢驗(yàn)方法〔FDA與ISO比照〕內(nèi)容提要：l 菌落總數(shù)檢測l 大腸菌群及大腸桿菌檢測l 金黃色葡萄球菌檢測l 沙門氏菌檢測l 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測菌落總數(shù)測定——菌落總數(shù)的概念l 菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量〔g〕、容積〔ml〕或外表積〔cm2〕內(nèi)，所含能于某種固體培育基上，在肯定條件下培育后所生成的菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)測定——衛(wèi)生學(xué)意義l 判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。l 準(zhǔn)時反映食品加工過程是否符合衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學(xué)評價供給依據(jù)。l 通常認(rèn)為，食品中細(xì)菌數(shù)量越多，則可考慮致病菌污染的可能性越大，菌落總數(shù)的多少在肯定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。FDABAM菌落總數(shù)測定流程檢樣xg/mL+9xml稀釋液〔磷酸鹽緩沖液〕適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇2~3個連續(xù)適宜稀釋度各1mL分別參加滅菌平皿內(nèi)〔每個稀釋度做兩個平行〕每皿內(nèi)參加適量平板計數(shù)瓊脂〔PCA〕35℃48±2h菌落計數(shù)FDABAM菌落計數(shù)方法l 25~250CFU之間的菌落進(jìn)展計數(shù)，計算公式如下：N=∑C/〔1*n1+0.1*n2〕*dl 全部平板的菌落數(shù)都缺乏25CFUEAPC/mg為＜25*1/d。Caerobicplatecountl 全部平板的菌落數(shù)都超過250CFU，但缺乏100/cm2，報告EAPC/ml〔g〕為最接250CFUl 全部平板的菌落數(shù)都超過100/cm2，計算平板的面積〔直徑為90mm的平板面積為65cm2〕，估量最高稀釋度每cm2EAPC/ml〔g〕為＞65*100*1/d。l LA〔LaboratoryAccident〕。l 46，5菌落總數(shù)測定流程檢樣xg/mL+9xml稀釋液〔磷酸鹽緩沖液〕適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇2~3個連續(xù)適宜稀釋度各1mL分別參加滅菌平皿內(nèi)〔每個稀釋度做兩個平行〕〔12~15mL〕平板計數(shù)瓊脂〔PCA〕，

30±1℃，72±3h菌落計數(shù)菌落計數(shù)方法l 選擇連續(xù)2個稀釋度不超過300CFU的平板，且一個平板至少含15CFU進(jìn)展計數(shù)，計算公式如下：N=∑C/〔n1+0.1*n2〕*dl 全部平板的菌落數(shù)都缺乏15CFU，計算2平板菌落的算術(shù)平均值m，液體樣品：NE=m 固體樣品：NE=m×d-1l 無菌生長：液體樣品：lessthan1; 固體樣品：lessthan1×d-1l 最終結(jié)果保存前兩位有效數(shù)字。菌落總數(shù)測定幾點(diǎn)說明l 由于檢樣中承受30/35℃有氧條件下培育，因而并不是樣品中實(shí)際的總活菌數(shù)，一些特別養(yǎng)分要求的細(xì)菌、厭氧菌、微需氧菌、以及非嗜中溫細(xì)菌，均難以反映出來。l 鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個、成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，〔colonyformingunits，CFU〕報告。菌落總數(shù)測定幾點(diǎn)要求l 每個樣品從開頭稀釋到傾注最終一個平皿所用的時間不得超過15min，主要為防止細(xì)菌增殖和產(chǎn)生片狀菌落。樣液與瓊脂應(yīng)充分混合，避開將混合物濺到平皿壁和皿蓋上。皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長時間放置，然后倒置培育，可避開菌落集中生長。l 檢樣過程中應(yīng)用稀釋劑做空白比照，用以判定稀釋液、培育基、平皿或吸管可能存在的污染。同時，檢樣過程中應(yīng)在工作臺上翻開一塊空白平板計數(shù)瓊脂，其暴露時間應(yīng)與檢樣時間相當(dāng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有無受到來自空氣的污染。l 檢樣稀釋液有時帶有食品顆粒，為避開與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液4℃放置，以便在計數(shù)檢樣時用作比照。大腸菌群的定義l 大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。l 大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名，而是依據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求，提出的與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即作為食品、水體等是否受過人畜糞便污染的指示菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全全都。依據(jù)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，可將這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌〔俗稱大腸桿菌〕、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸桿菌的定義l 大腸桿菌〔也稱大腸埃希氏菌〕，分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。l 大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗(yàn)〔靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)〕為++--或-+--的細(xì)菌。l 與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌〔ETEC〕、致病性大腸桿菌〔EPEC〕、出血性大腸桿菌〔EHEC〕、侵襲性大腸桿菌〔EIEC〕、黏附性大腸桿菌〔EAEC〕。衛(wèi)生學(xué)意義l 大腸菌群和大腸桿菌是評價衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。l 食品中檢出大腸菌群，說明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過污染的食品引起腸道傳染病的流行大腸菌群數(shù)的凹凸說明白糞便污染的程度，也反映了對人體安康危害性的大小。l 大腸桿菌在外界存活時間與一些主要腸道致病菌接近，它的消滅預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來，有些國家在執(zhí)行HACCP治理HACCP培育特性：l 大腸桿菌合成代謝力量強(qiáng)，在含無機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的一般培育基上生長良好。37℃，42-4415-46℃大腸菌群及大腸桿菌測定——MPN〔FDABAM〕50g+450ml適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度接種三管LST肉湯〔每管9mlLST肉湯并加有導(dǎo)管〕，1mL35℃，24±2h~48±2h沒有產(chǎn)氣管 有產(chǎn)氣管報告陰性BGLB管 接種EC肉湯44.5±〔水浴培育〕接種EMB平板〔35℃、18~24h〕

24±2h~48±2h查MPN表報告結(jié)果 產(chǎn)氣管〔大腸菌群〕 從EMB5PCA面，進(jìn)展革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接 種LST復(fù)檢產(chǎn)氣MPN〔大腸桿菌〕大腸菌群測定——MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說明l MPN檢索表：MPN檢索表只給了三個稀釋度如改用不同的稀釋度則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。l 初發(fā)酵和證明試驗(yàn)：兩步法進(jìn)展了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證明試驗(yàn)所用培育基不同，但都是為了證37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。初發(fā)酵陽性管，不能確定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過證明試驗(yàn)后，有時可能成為陰性。測工作中，證明試驗(yàn)是必需的。l 產(chǎn)氣量與倒管：〔有時比小米粒還小〕，糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。大腸桿菌測定——EMB選擇性分別鑒別EMB中心黑色或紫紅色，有或無綠色金屬光澤大腸桿菌測定——EMBl EMB是一種弱選擇性培育基，一些球菌也可在該培育基上生長；l 高壓滅菌可使得美藍(lán)復(fù)原從而使培育基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動培育基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻；l 大腸桿菌在該培育基上并不肯定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；l 該培育基受可見光易使其中的成分氧化，儲存及培育細(xì)菌時都應(yīng)在避光條件大腸桿菌測定——革蘭氏染色根本步驟：l 將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；l 滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；l 滴加95%乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；l 滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。l 結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。大腸桿菌測定——生化鑒定〔表略〕金黃色葡萄球菌——概述l 依據(jù)《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》，按葡萄球菌的生理化學(xué)組成，將葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)，其中金葡多為致病性菌，表葡間或致病。l 金黃色葡萄球菌是人類化膿性感染中最常見的病原菌?？梢鹁植炕撔愿腥荆绨X、癰、皮下膿腫、外科切口及燒傷創(chuàng)面的感染；也可引起肺炎、偽膜性腸炎、腎盂腎炎、心要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。金黃色葡萄球菌——生物學(xué)特性金黃色葡萄球菌呈球形，直徑0.8μm左右，排列成葡萄串狀，無芽孢，無莢膜。金黃色葡萄球菌——生長特性l 金黃色葡萄球菌在肉湯中呈渾濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時液體澄清，菌量多時呈渾濁生長金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——方法適用性l MPN法：適用于檢測帶有大量競爭菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的含少量金黃色葡萄球菌的食品。l 直接平板計數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g〔ml〕的食品。l 增菌培育法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——直接平板計數(shù)法〔FDABAM&ISO〕檢樣〔50g+450mL稀釋液〕品選擇2~3個連續(xù)適宜稀釋度吸取1ml菌液依據(jù)0.3mL、0.3mL、0.4mL分別涂布于390mmBaird-Parker〔做平行試驗(yàn)〕45~48h確證試驗(yàn)報告FDABAM金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——MPN檢樣〔50g+450mL〕

適當(dāng)十倍稀釋樣35適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，10%NaClTSB1mL35℃，48±2h從生長的管中接種1環(huán)劃線于Baird-Parker平板上35℃，48h確證試驗(yàn)報告FDABAM1.凝固酶試驗(yàn)l 1TSB/BHI肉湯中，35℃培育18-24h0.3mL同0.5mL凝固酶試驗(yàn)兔血漿充分混合，置35℃培育，6h。試驗(yàn)中需同時做陽性和陰性比照。l 〔2+3+〕的必需進(jìn)展生化鑒定加以證明。FDABAM金黃色葡萄球菌確證試驗(yàn)2.革蘭氏染色l 對全部的可疑培育物都要進(jìn)展革蘭氏染色。3.生化鑒定l 過氧化氫酶試驗(yàn)l 葡萄糖厭氧利用試驗(yàn)l 甘露醇厭氧利用試驗(yàn)l 金葡溶菌酶敏感性試驗(yàn)l ISO金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——MPN樣〔xg+9xmL〕適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度接種三管modifiedGiolittiandCantonibroth，37℃，24~48h從變黑或消滅黑色沉淀的管中1環(huán)培育物于Baird-Parker37℃，48h確證試驗(yàn)報告沙門氏菌屬簡介l 1880E.Berth1885年Salmon與Smith亂沙門氏菌，以后取Salmon氏之名為本菌屬之名。l 沙門氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學(xué)相關(guān)的革蘭氏陰性、需氧性、無芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原構(gòu)造簡單，現(xiàn)已覺察2023多個血清型，我國已覺察血清型200沙門氏菌屬——生物學(xué)特性形態(tài)特征：革蘭氏陰性，大小為1~3×0.4~0.9μm的兩端鈍圓的短桿菌，無芽孢，一般無莢膜，除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌以外，都有周身鞭毛，運(yùn)動力強(qiáng)。培育特性：l 沙門氏菌需氧或兼性厭氧，10-42℃都可生長，最適生長溫度為37℃，最適pH6.8~7.8。l 養(yǎng)分瓊脂平板上：35~37℃培育18~24h，其菌落大小一般為2~3mm，光滑、潮濕、無色、半透亮、邊緣整齊。l 血平板上：中等大小的灰白色菌落。沙門氏菌屬的抗原l 菌體抗原〔O〕l 外表抗原〔K〕：ViMl 鞭毛抗原〔H〕l 纖毛抗原FDABAM前增菌 25g樣+225mL乳糖肉湯〔肉制品、肉副產(chǎn)品、動物產(chǎn)品〕2min，室溫放置60±5minPH6.8±0.235℃、242h選擇性增菌0.1ml+10mlMM〔RV〕 1ml+10mlTTB42℃、24h〔水浴培養(yǎng)〕 35℃、24h 、24h〔水浴培育〕含菌量高 含菌量低分別培育 劃線接種選擇性培育基〔BS、XLD、HE〕35℃、24~48h〔BS〕生化鑒定 每個平板挑取至少2個可疑菌〔包括典型和非典型各2個〕TSI三糖鐵、LIA賴氨酸鐵高層斜面〔LIA高層深4cm〕〔松蓋以保持有氧條件防止產(chǎn)生過多H2S〕35℃、24±2h棄去 尿素酶試驗(yàn) 衛(wèi)矛醇、 氰化鉀、丙二酸鈉、吲哚試驗(yàn)陽性 陰性血清學(xué) 血清學(xué)試驗(yàn)——沙門氏菌的分類報告結(jié)果ISO6579前增菌 25g樣+225mLBPW勻質(zhì)37±1℃、182h選擇性增菌0.1ml+10mlRVS 1ml+10mlMKTTn41.51℃、243h 371℃、243h〔水浴培育〕分別培育 劃線接種選擇性培育基〔XLD和其次種選擇性培育基，如BS〕37℃、24~48h〔BS〕每個平板挑取至少5個可疑菌進(jìn)展純培育和確認(rèn)試驗(yàn)37℃、24±3h生化鑒定 TSI、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、β-牛乳糖、V-P、吲哚試驗(yàn)血清學(xué) 血清學(xué)試驗(yàn)——沙門氏菌的分類沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分別培育XLDFDABAM——典型菌落：粉色菌落，帶或不帶黑色中心。很多沙門氏菌培育物可呈現(xiàn)大的具光澤的黑色中心或幾乎為全部黑色的菌落。——非典型菌落：黃色帶或不帶黑色中心。ISO——中心黑色、四周由于指示劑顏色的轉(zhuǎn)變而消滅紅色的稍微透亮帶。菌名 菌落形態(tài)鼠傷寒沙門氏菌 傷寒沙門氏菌 紅色，有黑心弗氏志賀氏菌 紅色大腸埃希氏菌 糞鏈球菌 -沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分別培育BSFDABAM——典型菌落：產(chǎn)硫化氫菌落黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落四周的培育基通常開頭呈褐色，但伴隨培育時間的延長而變?yōu)楹谏?，并有暈環(huán)效應(yīng)；——非典型菌落：有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色菌落，四周培育基不變色。沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分別培育HEFDABAM——典型菌落：蘭綠色至蘭色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落帶或不帶黑色,中心或幾乎全黑色。——非典型菌落：乳糖陽性的菌株為黃色中心黑色或全黑色。TSI：典型反響：斜面產(chǎn)堿〔K〕：紅色；底部產(chǎn)酸〔A〕：黃色；產(chǎn)H2S：黑色〔少數(shù)不產(chǎn)〕沙門氏菌檢驗(yàn)——幾點(diǎn)留意l 冷凍樣品解凍需在45℃以下，有自動調(diào)溫器自控的水浴鍋內(nèi)不斷攪拌進(jìn)展15min2-8℃，18清學(xué)鑒定。l 進(jìn)展生化反響時，應(yīng)以純培育物進(jìn)展試驗(yàn)，如消滅血清學(xué)陽性，而生化反響特征不符合時，應(yīng)對接種物進(jìn)展純化，用純化后的培育物重進(jìn)展生化試驗(yàn)。測試中應(yīng)同時接種陽性比照菌株。李斯特菌屬簡介l 《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》第9版中，李斯特菌屬有7個種：單核細(xì)胞增生李斯特氏菌〔L.monocytogenes〕、英諾克李斯特氏菌〔L.innocua〕、西爾李斯特氏菌〔L.seeligeri〕、威爾斯李斯特氏菌〔L.welshimeri〕、綿羊李斯特氏菌〔L.ivanovvi〕、格氏李斯特氏菌〔L.grayi〕〔L.murrayi〕。l 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起動物的感染，也可引起人的感染。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌——生物學(xué)特性培育特性：l 生長溫度為2~42℃〔冷藏不能阻擋該菌的生長〕，最適生長溫度為35~37℃。20~25，37筋斗運(yùn)動。l 在pH3.8~4.4仍能生長，在pH中性至弱堿性〔9.6〕、氧分壓略低、二氧化碳張6.5%NaCll 血平板上：菌落通常不大呈灰白色，刺種血平板可產(chǎn)生窄小的β溶血環(huán)。FDABAM25g增菌 EB增菌液根底225mL30℃ 4h參加抑菌劑30℃ 20h 30℃ 44h選擇性分別培育 接種OXA和PALCAM 接種OXA和PALCAM35℃ 24-48h 35℃ 24-48h生化鑒定 TSA-YE純培育30℃24-48h典型運(yùn)動 TSB-YE革蘭氏染色溶血試驗(yàn)ISO測試樣品〔xgxmL〕+9xmL〔HalfFraser〕30℃24±2h1mL培育液參加 劃Oxford瓊脂10mL二次增菌培育基中 和PALCAM〔Fraser〕35℃37℃培育48±2h 30℃、35℃或37℃24-48hOxford脂PALCAM30℃、35℃37℃24-48h李斯特菌屬確實(shí)證：動力試驗(yàn)

過氧化氫酶試驗(yàn)

挑取可疑菌接種TSAYE培育基溶血試驗(yàn)碳源利用試驗(yàn)試驗(yàn)

單核細(xì)胞增生李斯特菌確實(shí)證：CAM〔協(xié)同溶血〕單核細(xì)胞增生李斯特氏菌——溶血試驗(yàn)l 制備5~7%羊血瓊脂平板。l 挑取TSAYE平板上的典型菌落刺種血平板，刺種時避開接觸到平板底部和使瓊脂裂開，同時接種陽性〔單核細(xì)胞增生李斯特氏菌〕和陰性〔英諾克李斯特氏菌〕比照。l β-溶血；l 西爾李氏菌消滅弱的溶血現(xiàn)象；l 綿羊李氏菌通常呈寬的、輪廓清楚的β-溶血；l 英諾克李氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌——協(xié)同溶血試驗(yàn)〔CAMP〕l 方法：在羊血瓊脂平板上平行接種β-溶血金黃色葡萄球菌〔S.aureus〕和馬紅球菌(R.equi),在它們中間垂直劃線接種可疑菌，與兩線相近但不相交，在30℃培育24h-48h,檢查平板中垂直接種點(diǎn)對溶血環(huán)的影響。l 結(jié)果：靠近金黃色葡萄球菌接種點(diǎn)的單增李斯特氏菌的