紫外-可見分光光度法課件

第四章紫外-可見分光光度法

(ultravioletvisiblespectrophotometers)歷史悠久，應用最為廣泛的一種光學分析法。利用被測物質(zhì)對光的吸收特征和吸收強度，對物質(zhì)進行定性、定量分析的一種分析方法。紫外可見分光光度法是在比色的基礎上發(fā)展起來的。1第四章紫外-可見分光光度法

(ultravioletv第一節(jié)光的吸收定律一、郎伯-比爾（Lambert-Beer）定律1.透光度和吸光度當一束單色光通過溶液時，一部分被吸收，一部分透過溶液，一部分被容器表面反射。2第一節(jié)光的吸收定律一、郎伯-比爾（Lambert-Bee設入射光強度為I0，吸收光強度為Ia，透射光強度為It，反射光強度為Ir，則3設入射光強度為I0，吸收光強度為Ia，透射光強度為It在分光光度分析中，通常將待測溶液和參比溶液分別置于同樣材料和厚度的容器中，讓強度為I0的單色光分別通過兩個容器，再測量透射光強度。這樣，反射光的強度基本相同，其影響可以互相抵消，則4在分光光度分析中，通常將待測溶液和參比溶液分別置于同樣當一束單色光通過溶液后，由于吸收了一部分光能，光的強度就會減弱。當光透過濃度為c，液層厚度為b的溶液時，由于一部分光被吸收，因此5當一束單色光通過溶液后，由于吸收了一部分光能，光的強度隨著溶液濃度和液層厚度的增加，光被吸收的程度增加，透射光的強度減小。透射光強度與入射光強度之比稱為透光度（transmittance），用T表示：6隨著溶液濃度和液層厚度的增加，光被吸收的程度增加，透射

例如，入射光的強度為100，透射光的強度為35，則T=0.35或35%。

溶液的透光率愈大，表示它對光的吸收程度愈??；相反，透光率愈小，對光的吸收程度愈大。7例如，入射光的強度為100，透射光的強度為35，則T實踐證明，溶液對光的吸收程度與溶液濃度、液層厚度及入射光波長等因素有關。如果保持入射光不變，則溶液對光的吸收程度只與溶液濃度和液層厚度有關，即8實踐證明，溶液對光的吸收程度與溶液濃度、液為了方便起見：吸光度（absorbance）吸光系數(shù)液層厚度溶液濃度9為了方便起見：吸光度（absorbance）吸光系數(shù)液層厚度當a、c一定時，A∝bLambert’slaw當a、b一定時，A∝cBeer’slawLambert-Beer定律可表述為：在一定條件下，物質(zhì)的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比，稱為光吸收定律，是吸收光譜定量的依據(jù)。10當a、c一定時，A∝bLambert’slaw當a、bLambert-Beer定律是均勻、非散射介質(zhì)對光吸收的基本定律，只有對入射光是單色光才完全適用。11Lambert-Beer定律是均勻、非散偏離比爾定律的因素主要原因歸納如下：

1.待測組分的濃度過高

2.化學反應的影響

3.譜帶寬度過大

4.pH值的影響

5.雜質(zhì)的影響

6.光散射的影響12偏離比爾定律的因素主要原因歸納如下：122.吸收系數(shù)absorptivitya為吸收系數(shù)，是指在一定入射光波長下，單位濃度及單位液層厚度時的吸光度。即一般b的單位為cm，a的單位與c的單位有關。132.吸收系數(shù)absorptivitya為吸比吸光系數(shù)specificabsorptivity比吸光系數(shù)是指一定波長時，溶液濃度為1%（w/V），厚度為1cm的吸光度，用表示。14比吸光系數(shù)specificabsorptivity摩爾吸光系數(shù)molarabsorptivity摩爾吸光系數(shù)是指一定波長時，溶液濃度c為1mol/L，液層厚度b為1cm時的吸光度，用表示。15摩爾吸光系數(shù)molarabsorptivity和不能直接測得，需用已知準確濃度的稀溶液測吸光度計算得到。16和不能直接測得，需用已知準確濃度的稀溶液測吸解：例：稱取1.00mg維生素B12(M=1355)，配成25.00ml水溶液，吸收池厚度為0.5cm，在361nm波長下測得吸光度為0.414，計算摩爾吸光系數(shù)。17解：例：稱取1.00mg維生素B12(M=1355)，配成2例：用純氯霉素配制100ml含2.00mg的溶液，在278nm，用1.00cm的吸收池，測得T=24.3%，求比吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù)。18例：用純氯霉素配制100ml含2.00mg的溶液，在278與物質(zhì)的本性、溶劑和入射光的波長有關，即（1）物質(zhì)不同，不同，是物質(zhì)的特性常數(shù)。（2）溶劑不同，同一物質(zhì)的不同，所以應注明溶劑。19與物質(zhì)的本性、溶劑和入射光的波長有關，即（1）物質(zhì)不同，（3）不同，同一物質(zhì)的吸收系數(shù)也不同，所以吸收系數(shù)應注明波長；（4）入射光的純度：單色光是經(jīng)單色器色散成波長范圍很窄的光。實際上，不管單色器的分辨率有多高，所謂的單色光仍然是有一定的寬度的。例如高錳酸鉀溶液的吸收曲線。20（3）不同，同一物質(zhì)的吸收系數(shù)也不同，所以吸收系數(shù)應如果在AB范圍內(nèi)，～1700，CD范圍內(nèi)～2300，EF范圍～2500。因此，還應考慮單色光的純度，即使用儀器的精確度（光強和色散元件的分辨率。21如果在AB范圍內(nèi)，～1700，CD范圍內(nèi)～2300第二節(jié)紫外—可見分光光度計紫外—可見分光光度計的類型很多，但其原理基本相似。一般由五部分構成，即光源、單色器、吸收池、檢測器、指示器（信號顯示裝置）22第二節(jié)紫外—可見分光光度計紫外—可見分光光一、分光光度計的主要部件1.光源對光源基本要求：足夠光強、穩(wěn)定、連續(xù)輻射且強度隨波長變化小。鎢及碘鎢燈：340～2500nm，多用在可見光區(qū)；氫燈和氘燈：160～375nm，多用在紫外區(qū)。23一、分光光度計的主要部件1.光源對光源基本要求：足夠光強、2.單色器單色器的用途就是把混合光變成單色光，由入射狹縫、準直鏡、色散元件、聚焦元件和出口狹縫組成。常用的色散元件有棱鏡和光柵。棱鏡是利用不同波長的光具有不同的折射率而使復合光分開的。用玻璃和石英制成。242.單色器單色器的用途就是把混合光變成單色光，由入光柵grating利用光的衍射和干涉作用使復合光分開。其特點是：色散波長范圍寬，可用于紫外、可見、紅外等光譜區(qū)，分辨率高，色散率基本上不隨波長改變而改變，即均勻色散（色散近于線性）?，F(xiàn)代儀器多用光柵作色柵元件。25光柵grating利用光的衍射和干涉作用使復合光縫狹縫狹是單色器的組成部分，對單色光的純度起著非常重要的作用。狹縫有兩種表示方法（1）用狹縫的實際寬度表示，以mm為單位，一般為0～2mm，（2）用通過出射狹縫的譜帶寬度表示，以nm為單位，如2nm、1nm、0.5nm及0.2nm等。狹縫愈窄，光的單色性愈好，測得的吸收峰愈尖銳，但光強度減弱，測定靈敏度降低。26縫狹縫狹是單色器的組成部分，對單色光的純度起著非常重要的作用轉(zhuǎn)動棱鏡或光柵，可使光譜移動，使不同波長單色光，從出射狹縫射出。27轉(zhuǎn)動棱鏡或光柵，可使光譜移動，使不同波長單色光，從出射狹縫射3.吸收池absorptioncell比色皿cuvette盛放樣品溶液的容器，用玻璃或石英制成，兩透光面互相平行，具有精確的光程。紫外區(qū)用石英、可見區(qū)用玻璃。盛放參比的吸收池和盛放樣品的吸收池應匹配，即有相同的厚度與透光性。吸收池的光學面應垂直于光束方向。283.吸收池absorptioncell比色皿cuve使用時，應進行校正（小于0.5%）由L—Blaw可知，當被測物的量一定時，V越?。╟越大），b越大，則A越大。改進吸收池的形狀，使每單位光程所占的溶液體積盡可能小，即光程/體積比即可能大。29使用時，應進行校正（小于0.5%）由L—Blaw可知，當常規(guī)吸收池1cm，5ml1/5=0.2微型吸收池，光程/體積比大于0.2的為微型吸收池（microcell）b=4cm，V=2，4/2=230常規(guī)吸收池1cm，5ml1/5=0.2微型吸收池，光程4.檢測器將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栠M行檢測。光電管利用光電效應的原理。光電流通過負載電阻R，將電流變成電壓信號，經(jīng)放大器放大后，輸給記錄儀。314.檢測器將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栠M行檢測。光電管利用光電暗電流電極的熱電子發(fā)射而產(chǎn)生的電流。暗電流愈小愈好。在分光光度計中，都設有補償電路，消除暗電流。

光電管有兩種：藍敏光電管，為銫陰極，適用波長200～625；紅敏管，銀氧化銫，適用波長625～100032暗電流電極的熱電子發(fā)射而產(chǎn)生的電流。暗電流愈小愈好

光電倍增管33光電倍增管33光二極管陣列檢測器photo-diodearraydetector光電二極管陣列檢測器是在晶體硅上緊密排列一系列光二極管，如HP8452A型，在190～820nm，由316個二極管，當光透過晶體硅時，二極管輸出的電訊號強度與光強度成正比。每一個二極管相當于一個單色儀的出口狹縫，兩個二極管中心距離的波長范圍，稱為采樣間隔，二極管愈多，分辨率愈高，每個二極管可在1/10s，每隔2nm測一次，同時并行采集數(shù)據(jù)，在1/10s時間內(nèi)，可獲全光譜。34光二極管陣列檢測器photo-diodearray電荷偶合陣列檢測器charge-coupleddevicearraydetector，CCD5.信號處理與顯示裝置光電管輸出的信號很弱，經(jīng)過放大后才能以某種方式將測量結果顯示出來。信號處理包括一些數(shù)學運算。顯示器可由電表、數(shù)字顯示、熒光屏顯示、結果打印、曲線掃描等。顯示方式有T、A，有的還可以轉(zhuǎn)換成濃度，ε等。35電荷偶合陣列檢測器charge-coupleddevi二、紫外可見光度計儀器分光光度計分為單波長和雙波長儀器。1.單波長分光光度計單光束雙光束（空間分隔）雙光束（時間分隔）特點：因光束幾乎同時通過樣品池和參比池，因此可消除光源不穩(wěn)產(chǎn)生的誤差。36二、紫外可見光度計儀器36光源檢測器單色器單色器切光器吸收池雙波長分光光度計示意圖2.雙波長分光度計通過切光器使兩束不同波長的光交替通過吸收池，測得吸光度差A。SB1和SB2分別為在1和2處的背景吸收，當1和2相近時，背景吸收近似相等。二式相減，得這表明，試樣溶液濃度與兩個波長處的吸光光差成正比。特點：可測多組份試樣、混濁試樣、而且可作成導數(shù)光譜、不需參比液(消除了由于參比池的不同和制備空白溶液等產(chǎn)生的誤差)、克服了電源不穩(wěn)而產(chǎn)生的誤差，靈敏度高。37光源檢測器單色器單色器切光器吸收池雙波長分光光度計示意圖2.第三節(jié)分光光度法的定性和定量分析吸收曲線、max和max，不同的化合物可能有相同的max，但不可能max和max完全相同，測max，通常配高、中、低三種濃度，在max處測A，計算max，求平均值。38第三節(jié)分光光度法的定性和定量分析吸收曲線光譜定性，有一定的局限性，主要是分辨率不高，在得到相同的吸收光譜時，應考慮并非同一物質(zhì)的可能性，而兩種純化合物的吸收光譜有明顯差別時，可肯定兩化合物不同。39光譜定性，有一定的局限性，主要是分辨率不高，在得到相同的吸收二、定量方法（一）單組分定量1.標準曲線法40二、定量方法（一）單組分定量1.標準曲線法40AcAxcx標準曲線41AcAxcx標準曲線41校準曲線、線性范圍和測定限校準曲線也稱校正曲線，是表示被測物質(zhì)濃度或量與測定儀器響應信號值之間的定量關系曲線，包括工作曲線和標準曲線。42校準曲線、線性范圍和測定限校準曲線也稱校正曲校正曲線的繪制線性回歸，即用最小二乘法求回歸方程43校正曲線的繪制線性回歸，即用最小二乘法求回歸方程43使用校正曲線時需注意：至少5個點，一般5～10個點，并且應至少一個數(shù)量級范圍。縱坐標上的最小刻度應與響應值的實際有效數(shù)字相適應。盡量使曲線的效率接近1。每次測定樣品時應同時繪制標準曲線。44使用校正曲線時需注意：至少5個點，一般5～10個點，并且應至線性范圍測定限上限、下限45線性范圍測定限上限、下限45靈敏度和檢出限靈敏度（Sensitivity）指該方法對單位濃度或量的被測物質(zhì)的變化所引起的分析信號值的變化程度。常以標準曲線的效率衡量。46靈敏度和檢出限靈敏度（Sensitivity）指該方法對檢出限Limitofdetection指對某一特定方法，在給定的置信水平內(nèi)，可以從試樣中定性檢出待測物質(zhì)的最小濃度或量。對于不同的系統(tǒng)，計算方法不同，即使同一系統(tǒng)，方法不同，計算方法也不同。IUPAC規(guī)定：47檢出限Limitofdetection對于光譜分析，可測量的最小分析信號xL為空白試驗多次測量的平均值根據(jù)一定置信度確定的系數(shù)空白試驗多次測量的標準差48對于光譜分析，可測量的最小分析信號xL為空白試驗多次測量的平與相對應的濃度或量即為檢出限L方法的靈敏度49與相對應的濃度或量即為檢出限L方法的靈敏度492.標準比較法該法是標準曲線法的簡化，即只配制一個濃度為cs的標準溶液，并測量其吸光度，求出吸收系數(shù)k，然后由Ax=kcx求出cx502.標準比較法該法是標準曲線法的簡化，即只該法只有在測定濃度范圍內(nèi)遵守L-B定律，且cx與cs大致相當時，才可得到準確結果。51該法只有在測定濃度范圍內(nèi)遵守L-B定律，且c（二）多組分定量方法

由于吸光度具有加合性，因此可以在同一試樣中測定多個組份。設試樣中有兩組份a和b，將其顯色后，分別繪制吸收曲線，會出現(xiàn)如圖所示的三種情況：52（二）多組分定量方法由于吸光度具有加合性，因53531.解方程組541.解方程組542.雙波長法—等吸收點法552.雙波長法—等吸收點法5