PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化課件

PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件1.目的基因分離(PCR）2.載體構(gòu)建3.轉(zhuǎn)化1.目的基因分離(PCR）31.目的基因分離(PCR）1.目的基因分離(PCR）4TherewasatimewhentoamplifyDNA,

Youhadtogrowtonsandtonsoftinycells.

ThenalongcameaguynamedDr.KaryMullis,

Saidyoucanamplifyinvitrojustaswell.

Justmixyourtemplatewithabufferandsomeprimers,

Nucleotidesandpolymerases,too.

Denaturing,annealing,andextending.

Wellit’samazingwhatheatingandcoolingandheatingwilldo.

PCR,whenyouneedtodetectmutations.

PCR,whenyouneedtorecombine.

PCR,whenyouneedtofindoutwhothedaddyis.

PCR,whenyouneedtosolveacrime從前你要擴(kuò)增DNA，

總有培養(yǎng)大批細(xì)胞的重任要你背。

這時有個家伙叫KaryMullis博士的，

他鉆出來說體外合成也一樣OK！

只要把你的模板混上緩沖液，再加些引物，還有核苷酸和聚合酶。變性，退火，和延伸。

加熱-冷卻-加熱太神奇了！

當(dāng)你想要檢測突變，來啊做PCR吧！

當(dāng)你想要基因重組，來啊做PCR吧！

當(dāng)你想知道孩子他爹到底是誰，來啊做PCR吧！

當(dāng)你想要偵破大案，來啊做PCR吧！PCR之歌目的基因分離(PCR）Therewasatimewhentoampli5PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件6PCR技術(shù)的原理PCR技術(shù)的原理7溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗需求為止。溫度（℃）時間（min）9494℃變性（1min）60℃退8PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件9PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件10PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件11PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件12PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件13PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件14PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件15PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件16PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件17引物設(shè)計常用軟件：DNAstar：序列分析Primer5.0：引物設(shè)計DNAman：序列比對在線引物設(shè)計：http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/引物設(shè)計常用軟件：182.載體構(gòu)建2.載體構(gòu)建19PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件20T-Vector連接T-Vector連接21反應(yīng)體系：2×LigationBuffer2.5μlInsetfraction1.5μlT-easyvector0.5μlT4-ligase0.5μl混勻后置16℃連接0.5-小時。熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌反應(yīng)體系：熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌22大腸桿菌感受態(tài)制備細(xì)菌細(xì)胞在一定的生理狀態(tài)（感受態(tài)），或經(jīng)CaCl2處理，或制備成原生質(zhì)體的情況下，都可吸收外源ＤＮＡ，利用這一特性可將重組ＤＮＡ導(dǎo)入受體細(xì)胞中，用質(zhì)粒作載體的遺傳工程一般使用這種方法。由于E.coli不會自發(fā)地產(chǎn)生感受態(tài)，因此E.coli的轉(zhuǎn)化一般采用鈣轉(zhuǎn)化法。該方法是將E.coli用冷CaCl2(0℃)致敏，而后在高溫（42℃）下熱休克，這樣可使外原DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。大腸桿菌感受態(tài)制備23涂平板（帶抗性ampr）（一）準(zhǔn)備工作：1、制好的帶選擇壓得平板，涂布器，ITPG，X-Gal器；槍頭，塑料板，酒精燈、記號筆，封口膜等，2、提前打開37℃培養(yǎng)箱（二）步驟1、把相關(guān)用具放入超凈臺，開紫外燈，10min.2、將ITPG從-20℃取出溶化。3、到時間后，燒涂布器，4、從4℃取出平板，置臺上。5、取40μlX-Gal于平板中央，6、取16μlITPG加入到40μlX-Gal上，涂勻上述液體，直到板面發(fā)澀為止。7、將熱擊產(chǎn)物100μl加于平板上，涂布均勻。8、涂好的板封口后標(biāo)記好質(zhì)粒種類、日期，制作人，倒置于37℃培養(yǎng)14小時。涂平板（帶抗性ampr）（一）準(zhǔn)備工作：24藍(lán)白斑篩選：野生型大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)。設(shè)計適用于藍(lán)白斑篩選的基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，無法作用于X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。操作中，添加IPTG以激活lacz‘中的β-半乳糖苷酶的啟動子，在含有X-gal的固體平板培養(yǎng)基中菌落呈現(xiàn)藍(lán)色（空載）。當(dāng)外源DNA與含lacz‘的載體連接時，會插入進(jìn)MCS，這種重組質(zhì)粒不再表達(dá)α肽鏈，不產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色，培養(yǎng)表型即呈現(xiàn)白色菌落。藍(lán)白斑篩選：野生型大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以將無色化25PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件26挑菌準(zhǔn)備工作:1、提前打開37℃搖床，開紫外燈殺菌。2、滅菌的帶蓋的刻度試管，試管架，消毒的黃槍頭，鑷子，Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基。步驟：1、將Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基分裝入試管，每管4-6ml。2、用黃色的槍頭挑白色的單克隆，連帶槍頭放入試管中。3、蓋上試管蓋，置搖床中，37℃，170轉(zhuǎn)搖培過夜（16-18小時）。挑菌準(zhǔn)備工作:27PCR、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化ppt課件28質(zhì)粒DNA提取采用改良的SDS堿裂解法，結(jié)合生物膜選擇性吸附DNA旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)快速純化質(zhì)粒DNA。

質(zhì)粒DNA提取采用改良的SDS堿裂解法，結(jié)合生物膜選擇性吸附29質(zhì)粒DNA提取準(zhǔn)備：1、檢查試劑是否齊全，夠用，-20℃預(yù)冷的無水乙醇2、滅菌的小三角瓶、槍及槍頭、計時器、塑料插板、記號筆、吸水紙、盛冰盒3、計算SII的用量（NaOH,SDS）步驟：1、在超凈臺內(nèi)將試管中的菌液移入1.5ml離心管中，2、1000rpm離心1.0min,其間取SI，和RNaseA,3、棄上清，留沉淀4、每管加入100μlSI和RNaseA0.4μl（RNaseA濃度為10.0mg/ml）（可提前算好總的SI和RNaseA用量，混勻后分裝于離心管中）5、充分渦旋均勻，6、計算好SII用量，臨時將0.4NNaOH,2%SDS等體積混合于滅菌的三角瓶中，7、每管加入混合好的SII200μl，輕輕上下顛倒幾次質(zhì)粒DNA提取準(zhǔn)備：30質(zhì)粒DNA提取8、插入冰盒中，靜置5min,此時菌液變的清亮粘稠9、每管加入SIII150μl，上下顛倒數(shù)次，此時有白色絮狀沉淀出現(xiàn)。10、冰浴5min11、13000rpm5min12、吸上清液于新離心管（約420μl）13、加入2倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇，上下顛倒，混勻，-20℃置30min以上。14、13000rpm5min，可見白色沉淀15、留沉淀，棄上清，加入70%乙醇900μl懸浮沉淀16、13000rpm5min17、棄上清，留沉淀，風(fēng)干后呈透明無色。18、加入30μlMQW，溶解沉淀。質(zhì)粒DNA提取8、插入冰盒中，靜置5min,此時菌液變的清亮31酶切鑒定準(zhǔn)備：1、提前開37℃水浴，2、檢查藥品、用具是否齊全3、合理安排時間，一般晚上做，37℃水浴過夜。4、盛冰盒。實(shí)驗在冰上進(jìn)行。步驟：1、反應(yīng)體系(20μl)10×BufferH2.0μlBSA0.2μlECORI0.5μlMQW16.3μl質(zhì)粒DNA1.0μl目的：檢測克隆片斷大小的準(zhǔn)確性酶切鑒定目的：檢測克隆片斷大小的準(zhǔn)確性32酶切結(jié)果檢測酶切結(jié)果檢測33測序取菌液若干個送生物公司測序填寫測序單測序取菌液若干個送生物公司測序34GateWay載體構(gòu)建:

通過去除冗長的亞克隆步驟節(jié)省時間

同時將您的基因轉(zhuǎn)移到多個表達(dá)系統(tǒng)

任何系統(tǒng)――體外，細(xì)菌，酵母，昆蟲，或哺乳動物――分析表達(dá)GateWay載體構(gòu)建:通過去除冗長的亞克隆步驟節(jié)省時間35GateWay載體構(gòu)建:完成構(gòu)建Gateway表達(dá)克隆僅需兩步：（1）創(chuàng)建入門克隆，通過PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因克隆進(jìn)入門載體。（2）混合包含目的基因的入門克隆和合適的目的載體以及GatewayLRClonase酶，構(gòu)建表達(dá)克隆。GateWay載體構(gòu)建:完成構(gòu)建Gateway表達(dá)克隆僅需36GateWay載體構(gòu)建:常用載體：入門載體（BP反應(yīng)）Pdnor222.1表達(dá)載體（LR反應(yīng)）PMDC32（超量表達(dá)）PMDC164（啟動子分析）PH7G（RNAi）pEarleyGate（ABRCstockDB-686）（亞細(xì)胞定位）