支原體檢測(cè)（DNA法）SOP

支原體檢測(cè)（DNA法）SOP編號(hào)：SOP-ZL006-001頁(yè)碼：1/5版本：01修訂號(hào)：00機(jī)密等級(jí)：秘密起草人起草日期頒發(fā)部門(mén)質(zhì)量管理部審核人審核日期批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期生效日期分發(fā)數(shù)量研發(fā)部[]質(zhì)量管理部[]綜合管理部[]生產(chǎn)管理部[]市場(chǎng)銷(xiāo)售部[]財(cái)務(wù)部[]目的規(guī)定新生牛血清中支原體DNA熒光法檢測(cè)操作程序。指導(dǎo)操作者按本程序進(jìn)行新生牛血清支原體DNA熒光法檢測(cè)的操作。適用范圍本程序包括細(xì)胞培養(yǎng)、加樣、染色、鏡檢等操作。適用于新生牛血清支原體DNA熒光法檢測(cè)操作全過(guò)程。職責(zé)3.1質(zhì)控部負(fù)責(zé)本程序的起草3.2總經(jīng)理負(fù)責(zé)本程序的審批3.3質(zhì)控部檢驗(yàn)人員負(fù)責(zé)本規(guī)程的操作定義4.1DNA脫氧核糖核酸Vero非洲綠猴腎細(xì)胞引用標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國(guó)藥典》四部2015版材料及設(shè)備6.1試劑6.1.1供試品及參考品/標(biāo)準(zhǔn)品6.1.3化學(xué)藥品及試劑6.1.4支原體熒光染色試劑盒（記錄廠家、批號(hào)和效期）6.1.5純化水，記錄批號(hào)。6.1.6Vero細(xì)胞（記錄細(xì)胞代次）6.1.7細(xì)胞生長(zhǎng)液，記錄批號(hào)。配制參見(jiàn)《細(xì)胞生長(zhǎng)液配制程序》SXRS-SOP02-1-0-59。6.2設(shè)備6.2.1超凈臺(tái)。參見(jiàn)《超凈工作臺(tái)使用與維護(hù)程序》SXRS-SOP02-1-0-426.2.2校驗(yàn)效期內(nèi)的熒光倒置顯微鏡1臺(tái)（記錄型號(hào)，編號(hào)）6.2.3校驗(yàn)效期內(nèi)的37℃CO2孵箱1臺(tái)（記錄型號(hào)，編號(hào)）。使用參見(jiàn)《CO2孵箱使用、滅菌及維護(hù)程序》SXRS-SOP02-1-0-41。6.3玻璃器皿及輔助用具/易耗品6.3.1經(jīng)過(guò)滅菌處理的操作衣、2ml吸管若干，蓋玻片，1個(gè)/批。如經(jīng)高壓滅菌則記錄高壓編號(hào)。6.3.2無(wú)菌醫(yī)療用品無(wú)菌帽、無(wú)菌口罩和橡膠檢查手套。記錄批號(hào)。6.3.375%酒精棉，參見(jiàn)《75%酒精棉配制程序》SXRS-SOP02-1-0-70。記錄批號(hào)。6.3.4燒杯.6.3.5六孔板，1個(gè)/2批供試品6.3.6載玻片，2個(gè)/批供試品流程圖無(wú)內(nèi)容8.1試驗(yàn)前的準(zhǔn)備8.1.1檢定用具的清洗準(zhǔn)備參見(jiàn)《物品準(zhǔn)備程序》，在滅菌72小時(shí)內(nèi)使用。8.1.2物料的進(jìn)入8.1.2.1滅菌物品放入操作間，記錄房間號(hào)。8.1.2.275%酒精棉、洗瓶、燒杯及試劑盒放入操作間。8.1.2.3帶蓋廢物桶放入操作間。8.1.2.4人員更衣進(jìn)入操作室。參見(jiàn)《人員進(jìn)出潔凈廠房程序》。8.1.2.5打開(kāi)超凈臺(tái)，紫外燈消毒50分鐘。操作前關(guān)閉紫外燈。8.2檢測(cè)程序8.2.1將染色試劑盒中的10倍濃縮染液拿到室溫下，搖勻。8.2.2將濃縮染液用HANK'S平衡鹽作1：10稀釋?zhuān)芄狻?.2.3細(xì)胞培養(yǎng)8.2.3.1把無(wú)菌蓋玻片放入六孔板中。8.2.3.2用吸管在六孔板中加入Vero細(xì)胞液，1ml/孔，讓細(xì)胞生長(zhǎng)在蓋玻片上。8.2.3.3把六孔板放入37℃孵箱，過(guò)夜孵育。8.2.3.4清場(chǎng)。參見(jiàn)《QC清場(chǎng)管理程序》。填寫(xiě)試驗(yàn)記錄和清場(chǎng)記錄。復(fù)核人復(fù)核并簽字。8.2.4加樣8.2.4.1啟動(dòng)超凈臺(tái)。8.2.4.2把六孔板從孵箱中拿出，放入超凈臺(tái)。8.2.4.3用吸管吸取2ml供試血清加入1個(gè)培養(yǎng)孔。8.2.4.4更換吸管，分別吸取其它批供試血清加入不同培養(yǎng)孔中，即2ml/孔，2孔/批血清。8.2.4.5每板加樣完畢，蓋上蓋子。8.2.4.6六孔板重放回37℃孵箱培養(yǎng)48-72小時(shí)，中途勿動(dòng)。8.2.4.7清場(chǎng)。參見(jiàn)《QC清場(chǎng)管理程序》。填寫(xiě)試驗(yàn)記錄和清場(chǎng)記錄。復(fù)核人復(fù)核并簽字。8.2.5染色8.2.5.1從孵箱中拿出細(xì)胞板，用吸管吸出培養(yǎng)液，每孔留1ml左右。8.2.5.2更換吸管，每孔加1ml固定液固定5分鐘。8.2.5.3倒掉孔中液體，再每孔加固定液固定10分鐘，加液量以能覆蓋蓋玻片為準(zhǔn)。8.2.5.4倒掉固定液，用鑷子取出蓋玻片放于六孔板蓋上，風(fēng)干。8.2.5.5每張風(fēng)干后的蓋玻片加1ml稀釋好的染液避光染色10-30分鐘。同時(shí)把試劑盒帶的陰性和陽(yáng)性對(duì)照染色。8.2.5.6用洗瓶把蓋玻片沖洗3次，再風(fēng)干。8.2.6鏡檢8.2.6.1細(xì)胞面朝下把蓋玻片封閉在潔凈載玻片上，拿到熒光顯微鏡下觀察。參見(jiàn)《熒光倒置顯微鏡使用與維護(hù)程序》。8.2.6.2填寫(xiě)熒光顯微鏡使用記錄。8.2.6.3完成試驗(yàn)記錄。復(fù)核人復(fù)核并簽字。8.2.6.4清場(chǎng)。參見(jiàn)《QC清場(chǎng)管理程序》。填寫(xiě)清場(chǎng)記錄。復(fù)核人復(fù)核并簽字。8.3僅見(jiàn)細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光，判為陰性；細(xì)胞核周?chē)写罅繜晒忸w?；蚪z狀點(diǎn)集于細(xì)胞表面，判為陽(yáng)性。8.4完成試驗(yàn)記錄，交主管復(fù)核確認(rèn)注意事項(xiàng)9.1.嚴(yán)格按照GMP要求規(guī)范操作，以防止檢定結(jié)果不成立。9.2.注意不得混淆不同名稱(chēng)和批號(hào)供試品9.3.使用的計(jì)量器具應(yīng)經(jīng)過(guò)計(jì)量校驗(yàn)9.4出現(xiàn)超標(biāo)結(jié)果，應(yīng)在試驗(yàn)記錄中如實(shí)記錄。9.5出現(xiàn)OOS情況，應(yīng)及時(shí)報(bào)告主管。參見(jiàn)《質(zhì)量檢驗(yàn)超出標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查分析程序》SXRS-SOP02-1-0-67，完成OOS記錄。附錄及派生記錄支原體檢測(cè)DNA記錄F-SOP-ZL006-01相關(guān)文件《細(xì)胞生長(zhǎng)液配制程序》《CO2孵箱使用、滅菌及維護(hù)程序》《物品準(zhǔn)備程序》《75%酒精棉配制程序》《人員進(jìn)出潔