分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)五：植物糖基轉(zhuǎn)移酶的RNA提取及擴(kuò)增一、實(shí)驗(yàn)思路：鐵筷子(HelleborusThibetanusFranch.)是毛茛科(Ranunculaceae)鐵筷子屬(Helleborus)多年生草本植物。其根莖呈結(jié)常狀圓柱形，稍扁，長(zhǎng)2.5?4.5cm,直徑3.5?7.0mm，較粗的通常有分枝，分枝頂端有莖痕和淺褐色干燥的小芽苞，表面黑褐色或灰黑色，常有數(shù)個(gè)類圓形窩狀莖痕，環(huán)紋在結(jié)節(jié)的膨大處較密，質(zhì)略硬，折斷面不平坦灰白色，常有裂隙，維管束點(diǎn)呈環(huán)狀排列，髓約占橫切面直徑的1/2。根莖上生有多數(shù)圓柱形細(xì)根，粗細(xì)較均勻，直徑0.6-2.0mm，表面黑褐色，有細(xì)縱皺紋和少數(shù)側(cè)根及側(cè)根痕，質(zhì)脆，易折斷，斷面灰白色，顯粉性。早春2月開花，花大，單生或2朵捧成單歧聚傘花序；萼片5，花瓣?duì)?，白色至粉紅色；花瓣小，呈管狀，不明顯；雄蕊多數(shù)，心皮2~3分離。4月結(jié)果，蓇葖果。5月種子成熟，呈黑色。主要生長(zhǎng)在秦嶺山區(qū)南北坡海拔1100?3100m的山地疏林或灌叢中。鐵筷子全屬約有20余種，主要分布在歐洲東南部和亞洲西部。其中的HelleborusThibetanusFranch.為我國(guó)特產(chǎn)種，又名黑毛七、小桃兒七、小山桃兒七、九百棒、嚏根草等，是陜西民間一種療效確切的草藥。其性涼味苦，有小毒，具清熱解毒、活血散瘀、消腫止痛之功效，主治膀胱炎、尿道炎、瘡癤腫毒及跌打損傷等癥。此外，鐵筷子花色美麗，亦可作為早春觀賞花卉。二、實(shí)驗(yàn)材料主要試劑及材料公司用途數(shù)量/價(jià)格鐵筷子液氮氨芐青霉素手術(shù)刀片

三、主要實(shí)驗(yàn)步驟：（一）樣品采集1.植物材料為五年大苗的鐵筷子，實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)選擇植物根莖，約1g,立即使用液氮冷凍，-80°C冰箱保存、備用。2．實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：1）配制0.1%的DEPC水（通風(fēng)櫥中配置）：用量筒量取去離子水1L，在通風(fēng)櫥中加入1mLDEPC到1L去離子水中，終濃度為0.1%的DEPC。迅速蓋上蓋子，混勻，然后放在37°C搖床中中速搖蕩至少4h。2）使用0.1%的DEPC水處理PCR管（0.2mL）、EP管（1.5mL）、研缽、鑷子。浸泡過夜，次日傾倒DEPC水。將PCR管、EP管滅菌，研缽、藥勺、鑷子用錫箔紙包裹180°C烘箱，2小時(shí)。（二）RNA提取1．準(zhǔn)備工作（試劑配實(shí)驗(yàn)所用的研臼、杵、小藥勺、試劑瓶、量筒、剪刀等與實(shí)驗(yàn)材料有接觸的器皿都要在0.1%的DEPC水中浸泡24h，用錫紙包裹于180°C（烘箱）高溫滅菌2h

或160°C高溫滅菌4h后備用；塑料制品如進(jìn)口槍頭、Eppendorf管（1.5mL,0.5mL）高壓滅菌，烘干后備用（放置時(shí)間不宜超過一周）。RNase-freewater的制備如下：在蒸餾水中加入0.1%體積的DEPC原液（如1000mL蒸餾水中加1mLDEPC原液），用塑料膜封口后，充分混勻，靜置過夜，高壓滅菌。（注意：DEPC有強(qiáng)誘癌作用，操作時(shí)須謹(jǐn)慎，加了DEPC的水放通風(fēng)櫥中，避免吸入氣體）操作前注意：RNase不易失活，在常規(guī)的高壓滅菌中無法使其失去活力，且空氣中、人的手上及唾液中都含有豐富的RNase，所以在分離RNA時(shí)應(yīng)該采取有效的措施，抑制和避免RNase的污染；所有試劑應(yīng)該用0.1%DEPC（即焦碳酸二乙酯）處理或用0.1%DEPC處理過的水配置，37°C過夜，高壓滅菌20min。1）避免外源RNase污染：儀器：RNasefree耗材、高溫或DEPC處理器皿。試劑：RNA實(shí)驗(yàn)專用、DEPC處理。人員：戴口罩、手套。環(huán)境：RNasefree工作區(qū)。2）避免內(nèi)源RNase污染操作快速。液氮研磨/液氮速凍。③RNA保存試劑。2．實(shí)驗(yàn)操作步驟以下實(shí)驗(yàn)采用Trizol試劑法，此方法是異硫氰酸胍法的改進(jìn)，可從103個(gè)細(xì)胞或毫克級(jí)的組織中有效提取RNA，如果操作得當(dāng)，獲得的RNA會(huì)比較完整而未降解，且不含蛋白和DNA的污染。1）稱取0.5g植物材料，在液氮中研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。注意：動(dòng)作盡量迅速，避免RNA降解；另外，要盡量地選用幼嫩的植物材料，因其RNA的含量相對(duì)于老材料要豐富。2）加入Trizol（比例：1mlTrizol/100mg植物材料），用槍頭反復(fù)抽吸混勻，之后劇烈震蕩混勻，室溫放置5min。（混合液呈棕紅色，可分成三大層：上層水相中含有RNA,中層含蛋白和下層有機(jī)相為材料殘?jiān)癉NA等）注意：樣品的量不要超過Trizol體積的10%,過多反而會(huì)降低RNA的得率。3）（此步可根據(jù)實(shí)際情況選擇做還是不做）當(dāng)樣品中蛋白、脂肪及多糖含量較高時(shí)，離心（4°C，12,000g，10min）,小心將上清液吸入1.5mL的Eppendorf離心管中。注意：RNA的抽提過程中的所有離心操作皆在4°C的冷凍離心機(jī)上進(jìn)行（下同）。然后就是在加入Trizol后，可以將裂解液放到-80°C凍存半小時(shí)以上，據(jù)說凍融過程中可以再次幫助更加充分的裂解細(xì)胞，分離蛋白和RNA。4）加入200rL氯仿，劇烈震蕩混勻15s，室溫放置2~3min，離心（4°C，12,000g，15min）。5）將上清液（約500乩1）小心的轉(zhuǎn)移至RNA-free的1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，輕柔顛倒混勻（動(dòng)作要緩和），-20°C冰箱中放置30min（過夜則沉淀更加充分）。6）12,000rpm，4℃，離心15min。7）小心移除上清液，收集RNA沉淀，加1mL75%乙醇輕輕洗滌沉淀1~2次（離心4°C，12000g，10~15min，棄上清，收集RNA沉淀）。注意：75%乙醇為無水乙醇和DEPC處理過的蒸餾水所配制。8）盡可能徹底吸除上清液，真空干燥3~5min或室溫下干燥15?20min使酒精完全揮發(fā)。注意：不應(yīng)該完全干燥失水，否則RNA沉淀很難溶解。9）沉淀用30~50rLDEPC-H2O溶解。10）（此步可根據(jù)實(shí)際情況選擇做還是不做）若該種植物含有較多多糖，則需在60°C水浴中溫浴5min,離心（4°C，12,000g，10min）吸取上清備用，此即為所需的RNA液。11）儲(chǔ)存在-80°C的超低溫冰箱中備用。12）測(cè)定RNA濃度?？墒褂迷噭┖刑崛?，E.Z.N.A.tmPlantRNAKit（OmegaBio-Tek，USA）。普通樣品方法：準(zhǔn)備材料:冷凍離心機(jī)（14,000乂8）、水浴鍋（能達(dá)到65°C）、1.5mLEP管（RNase-free）、槍頭（RNase-free）、100%乙醇、供巰基乙醇、液氮。具體操作：首先在RNAWashBufferII中加入48mL乙醇，室溫保存；在每1mL的RBBuffer中加入20rL的伏巰基乙醇，室溫保存一個(gè)月。為確定加入組織的量，事先稱量空EP管的重量。1）樣品處理，稱取0.5g植物材料，在液氮中研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。注意：研磨充分，看不到明顯顆粒；動(dòng)作盡量迅速，避免RNA降解；另外，要盡量地選用幼嫩的植物材料，因其RNA的含量相對(duì)于老材料要豐富。2）轉(zhuǎn)移100mg冰凍的研磨植物組織到新的1.5mLEP管中。注意：推薦先使用50mg組織，如果結(jié)果不理想，再增加樣品的量；樣品在第三步加入RBBuffer之前不能融化。3）立即加入500rLRBBuffer。高速渦旋以充分混勻。注意：RBBuffer一定要先加入佚巰基乙醇；確定所有的樣品都已經(jīng)完全懸浮并且溶液中沒有塊狀物，塊狀物會(huì)降低最后RNA產(chǎn)量。在2mL的CollectionTube中套上gDNAFilterColumn。將裂解液轉(zhuǎn)移到gDNAFilterColumn中。6）室溫下14,0008，離心5分鐘。7）轉(zhuǎn)移澄清的裂解液到新的1.5mLEP管中，不要振蕩或轉(zhuǎn)移任何不溶性的沉淀。測(cè)定裂解液的體積。8）加入0.5mL純乙醇。高速渦旋20sec。這一步將會(huì)形成沉淀物；沉淀物不會(huì)干擾DNA的純化。使用槍吹打10?15次可以打碎沉淀物。9）將HiBind@RNAMiniColumn套入2mLCollectionTube中。10）轉(zhuǎn)移700rL樣品至UHiBind@RNAMiniColumn,包括可能產(chǎn)生的沉淀物。11）室溫下12,0008，離心1分鐘。12）去除濾液，回收CollectionTube。13）重復(fù)步驟10~12，直到所有的樣品都轉(zhuǎn)移到柱子中?？蛇x操作：從這步開始可能需要進(jìn)行膜上的DNaseI的消化操作。不過不需要操作，則直接進(jìn)行到第14步。14）力口入400比RWFWashBuffer。15）室溫下10,000g，離心30sec。16）去除濾液，回收CollectionTube。17）將HiBind@RNAMiniColumn套入新的2mLCollectionTube中。18）力口入500rLRNAWashBufferII。注意：RNAWashBufferII一定要先用乙醇稀釋。19）10,0008，離心30sec。20）去除濾液，回收CollectionTube。力入500rLRNAWashBufferI。10,000g，離心30sec。23）去除濾液，回收CollectionTube。24）將空的HiBind@RNAMiniColumn以最高速度離心2min以干燥柱子。注意：這一步是去除殘留乙醇的關(guān)鍵步驟，乙醇?xì)埩粲锌赡軙?huì)影響到后面操作。25）將HiBind@RNAMiniColumn套入1.5mLEP管中。26）力口入50?100rLDEPC水。注意：確定DEPC水是直接加入到HiBind@RNAMiniColumn的基質(zhì)中。27）高速離心1min,將洗脫下的RNA保存于-70°C。注意：結(jié)合以下任何操作都能增加RNA的產(chǎn)量。在加入柱子之前，65°C預(yù)熱DEPC水。在室溫下靜置5min。增力洗脫液的體積。使用新的DEPC水重復(fù)洗脫操作（這步能夠增加產(chǎn)量，但是會(huì)降低濃度）。使用上一步使用DEPC水重復(fù)洗脫操作（這步能夠增加產(chǎn)量，同時(shí)不改變體積）。可使用試劑盒提取，EZN.A.tmPlantRNAKit（OmegaBio-Tek,USA）。困難樣品方法（植物含有大量的多糖和酚類物質(zhì)）：準(zhǔn)備材料：冷凍離心機(jī)（14,000xg）、水浴鍋（能達(dá)到65°C、55°C）、1.5mLEP管（RNase-free）、槍頭（RNase-free）、100%乙醇、供巰基乙醇、液氮。具體操作：首先在RNAWashBufferII中加入48mL乙醇，室溫保存；在每1mL的RBBuffer及RCLBuffer中加入20匹的伏巰基乙醇，室溫保存一個(gè)月。為確定加入組織的量，事先稱量空EP管的重量。1）樣品處理，稱取0.5g植物材料，在液氮中研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。注意：研磨充分，看不到明顯顆粒；動(dòng)作盡量迅速，避免RNA降解；另外，要盡量地選用幼嫩的植物材料，因其RNA的含量相對(duì)于老材料要豐富。2）轉(zhuǎn)移100mg冰凍的研磨植物組織到新的1.5mLEP管中。注意：推薦先使用50mg組織，如果結(jié)果不理想，再增加樣品的量;樣品在第三步加入RCLBuffer之前不能融化。3）立即加入500rLRCLBuffer。高速渦旋以充分混勻。注意：RCLBuffer一定要先加入佚巰基乙醇；確定所有的樣品都已經(jīng)完全懸浮并且溶液中沒有塊狀物，塊狀物會(huì)降低最后RNA產(chǎn)量。4）55°C溫育1~3min。5）室溫下10,0008，離心5分鐘。6）將裂解液轉(zhuǎn)移到gDNAFilterColumn中，室溫下14,000g，離心2分鐘（gDNAFilterColumn套在新的1.5mLEP管中）。7）加入一個(gè)體積的RCBBuffer到濾液中。高速渦旋20sec。注意:大多數(shù)情況下都能收集到450rL澄清的裂解液，然后加入450rLRCBBufer。不同樣品，收集的澄清裂解液體積會(huì)不一樣。轉(zhuǎn)移到新的EP管之后，測(cè)定裂解液的體積并加入相應(yīng)數(shù)量的RCBBuffer。8）將HiBind@RNAMiniColumn套入2mLCollectionTube中。9）轉(zhuǎn)移700rL樣品到HiBind@RNAMiniColumn,包括可能產(chǎn)生的沉淀物。10）室溫下12,0008，離心1分鐘（時(shí)間和轉(zhuǎn)速應(yīng)該都不夠）。11）去除濾液，回收CollectionTube。12）重復(fù)步驟9~11，直到所有的樣品都轉(zhuǎn)移到柱子中?？蛇x操作：從這步開始可能需要進(jìn)行膜上的DNaseI的消化操作。不過不需要操作，

則直接進(jìn)行到第13步。13）力口入400rLRWFWashBuffer。14）室溫下10,000g，離心30sec。15）去除濾液，回收CollectionTube。16）將HiBind@RNAMiniColumn套入新的2mLCollectionTube中。17）力口入500rLRNAWashBufferII。注意：RNAWashBufferII一定要先用乙醇稀釋。18）10,0008，離心30sec。19）去除濾液，回收CollectionTube。力入500rLRNAWashBufferI。10,0008，離心30sec。22）去除濾液，回收CollectionTube。23）將空的HiBind@RNAMiniColumn以最高速度離心1min以干燥柱子。注意：這一步是去除殘留乙醇的關(guān)鍵步驟，乙醇?xì)埩粲锌赡軙?huì)影響到后面操作。24）將HiBind@RNAMiniColumn套入1.5mLEP管中。25）力口入50?100rLDEPC水。注意：確定DEPC水是直接加入到HiBind@RNAMiniColumn的基質(zhì)中。26）高速離心1min,將洗脫下的RNA保存于-70°C。注意：結(jié)合以下任何操作都能增加RNA的產(chǎn)量（確定可行）。在加入柱子之前，65°C預(yù)熱DEPC水。在室溫下靜置5min。增力洗脫液的體積。使用新的DEPC水重復(fù)洗脫操作（這步能夠增加產(chǎn)量，但是會(huì)降低濃度）。使用上一步使用DEPC水重復(fù)洗脫操作（這步能夠增加產(chǎn)量，同時(shí)不改變體積）。|（三）RNA質(zhì)量檢測(cè)與結(jié)果分析RNA檢測(cè)采用甲醛變性電泳法和紫外吸收法相結(jié)合的辦法，RNA電泳液為1XMOPS1）配制1）配制1%瓊脂糖變性膠DEPC處理過的水46.5mL甲醛（37%,pH>3.5）3.0mL10XMOPS5.5mL瓊脂糖0.55g共55mL注意：制膠時(shí)先將水，MOPS,瓊脂糖熔化（可用微波爐），室溫放置至冷卻到60°C,再加入甲醛（劇毒，操作小心），混勻并置通風(fēng)櫥中，稍稍冷卻后倒入制膠器中。2）RNA電泳點(diǎn)樣液體系（每一離心管中）TOC\o"1-5"\h\z5XMOPS2rL去離子甲酰胺10rL甲醛3.5rLRNA4.5rL總體積為20rL65°C，水浴10min，再加少量EB和溴酚藍(lán)混勻后點(diǎn)樣，電泳（80V），電泳1?2h左右，紫外檢測(cè)中若能看到兩條清晰可區(qū)分的主帶（28S和18S）的RNA，則表明RNA完整無降解。一般認(rèn)為28S和18S真核細(xì)胞RNA比值約為2：1（從電泳的兩條主帶的亮度可判斷）。如該比值逆轉(zhuǎn)，則表明有RNA降解，因?yàn)?8SrRNA可特征地降解為類似18S的rRNA，在電泳圖象上表現(xiàn)為只有一條主帶或出現(xiàn)彌散等現(xiàn)象。1．準(zhǔn)備工作（試劑準(zhǔn)備）DEPC水的處理（通風(fēng)櫥中配置）：用量筒量取去離子水2L，在通風(fēng)櫥中，加入2mLDEPC到2L去離子水中，終濃度為0.1%的DEPC。迅速蓋上蓋子，混勻，然后放在搖床中中速搖蕩至少4h，再高壓滅菌。滅菌時(shí)將瓶蓋松開，15磅滅菌20min。10XMOPS緩沖液（即10XFA緩沖液）：500mL0.2mol/LMOPS（3-〔N-嗎琳〕丙磺酸）80mmol/LNaAc10mmol/LEDTANa2先用400mLDEPC水溶解3.3gNaAc,再20.9gMOPS后，加入10mL0.5mol/LEDTA,定容500mL。用0.22mm濾器過濾除菌，裝入棕色瓶中，室溫避光保存?；?.2mol/LMOPS（3-〔N-嗎啉〕丙磺酸）50mmol/LNaAc10mmol/LEDTA用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，臨用時(shí)用DEPC水稀釋。IxMOPS電泳緩沖液（即1x甲醛變性膠電泳緩沖液Ixrunningbuffer）：100mL10XMOPS20mL37%甲醛4mL水176mL一般在3次電泳結(jié)束后需更換此電泳緩沖液。5x甲醛變性膠加樣緩沖液（5xloadingbuffer）：10mL預(yù)先配制水飽和的溴酚藍(lán)溶液：在1.5mL離心管中加入約0.1mg溴酚藍(lán)，加入1mLDEPC水溶解，充分振蕩溶解，離心，可見離心管底部有溴酚藍(lán)粉末剩余，上層液體即水飽和的溴酚藍(lán)液。在15mL滅菌離心管中，依次加入以下各種成分：4.0mL10xFAbuffer3.1mL甲酰胺2.0mL100%的甘油720rL37%的甲醛80rL0.5MEDTA（pH8.0）16rL水飽和的溴酚藍(lán)100rLDEPC水混勻，分裝，-20°C保存，常用放4°C保存?；蚣兹┠z變性RNA電泳加樣緩沖液（10x）：10mL50%甘油mmol/LEDTA0.25%溴酚藍(lán)0.25%二甲苯氰5mL甘油、20rL0.5mol/LEDTA、25mg溴酚藍(lán)、25mg二甲苯氰，力口DEPC水至10mL,高壓滅菌后，4°C保存。2．實(shí)驗(yàn)步驟1）電泳槽用0.3%H2O2浸泡30min,DEPC水沖洗晾干。鋪膠（50mL）瓊脂糖0.55gTOC\o"1-5"\h\zDEPC水36mL10XMOPS5mL37%甲醛9mL稱0.55克瓊脂糖加36mLDEPC水，微波爐加熱溶解瓊脂糖，肉眼觀察無顆粒狀懸浮物。冷卻至50-60°C,加9mL甲醛（37%）和5mL10X電泳緩沖液，然后灌制凝膠,插入合適長(zhǎng)度和寬度的梳子,于室溫放置30分鐘以上使凝膠凝固。RNA樣品處理（以一條泳道為例）一般取0.3g的總RNA,加入1/5體積的5x加樣緩沖液，65°C加熱5min,冰上驟冷，以消除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。建議上樣前在RNA樣品中加入0.5?1.0rL的溴化乙錠（EB,濃度1.0mg/mL）,而不在膠中加EB,這樣電泳后的背景較低。配好的甲醛變性膠先在1x甲醛變性膠電泳緩沖液中預(yù)電泳15min。RNA樣品在5~10V/cm的電壓降下電泳30min。4）加2.0mL甲醛凝膠加樣緩沖液（10x）5）加樣和電泳將凝膠預(yù)電泳15min,電壓降為5-10v/cm。隨后加樣品和標(biāo)準(zhǔn)物，以3-4v/cm電壓降電泳，電泳液為1XMOPS電泳緩沖液。直至溴酚藍(lán)遷移至膠下游的3/4處。6）電泳結(jié)束后，在紫外燈下，仔細(xì)測(cè)量28SrRNA和18SrRNA至加樣孔的距離，并同熒光尺一起拍照,以記錄標(biāo)準(zhǔn)物的位置。（四）提取的RNA檢測(cè)OD值（冰上操作，一般稀釋100倍，RNA提取試劑盒說明書，改為用TE緩沖液稀釋）分光光度計(jì)預(yù)熱15min,設(shè)置參數(shù)，TE緩沖液調(diào)零測(cè)OD值。取2rLRNA加到1998rLTE緩沖液（稀釋1,000倍）中，用分光光度計(jì)（如U3000）測(cè)OD260nm和OD280nm,并計(jì)算它們的比值，來分析RNA的純度。比值若為2.0，這是一個(gè)理想值，表明無雜質(zhì)的污染，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中要求比值必須達(dá)到1.85~2.0之間為佳。若低于1.7則可能是由于蛋白污染所致，若高于2.0則可能是由于含有其他一些藥劑的殘留所致?？俁NA"g）=OD260nmx40^g/mLx1000（稀釋倍數(shù)）義總RNA溶液體積（rL）/1000（五）植物總RNA提取小結(jié)（實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)）由于RNA極易被RNA酶降解，加上RNA酶非常穩(wěn)定而且廣泛存在（如玻璃制品、塑料制品、電泳槽及手和唾液等），因此在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性。本實(shí)驗(yàn)中主要采取下列措施：1）所有玻璃器皿使用前均須在180度的烘箱中烘烤3h以上，塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿洗滌。RNA電泳槽，須先用去污劑洗滌后，用水沖洗，乙醇干燥，再浸泡于3%H2O2

溶液中，室溫下放置10min，然后用0.1%DEPC水徹底沖洗，晾干備用。RNA實(shí)驗(yàn)所用的設(shè)備應(yīng)專門準(zhǔn)備一套，例如移液槍、槍頭盒和電泳槽等可貼上RNA專用的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)過程中勤換一次性手套。5）為避免RNA酶的污染，提取RNA的所有試劑和用具物品必須是專用的，必須小心操作，保證試劑藥品如Trizol，氯仿和異丙醇等不被污染。6）提取前可先用無水乙醇或氯仿對(duì)通風(fēng)櫥中的操作桌面進(jìn)行清理工作，再將待用的物品如移液槍、槍頭盒及離心管架等放置好。7）在RNA的提取過程忌講話談?wù)?，忌人員走來走去。8）DEPC和甲醛等劇毒物品，應(yīng)小心按有關(guān)的實(shí)驗(yàn)規(guī)定進(jìn)行操作和處理。3．RACETheRTproductwassubjectedtorapidamplificationofcDNAends(RACE)accordingtothemanufacturer’sprotocol.Adegenerateprimerwasdesignedfor3'-RACEbasedontheaminoacidsequencesintheconservedPSPG-boxofplantglycosyltransferases(GTs，F(xiàn)igureS1).Toget3'-endsofMiUGTs，3'-RACEwasperformedwithaSMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit(Clontech，USA)，andtheamplifiedfragmentsweresubjectedto5'-RACEasthegene-specificprimertogetthe5'-endsofMiUGTs.Thefull-lengthMiUGTswereamplifiedbyPCRusinggene-specificprimerpairs(TableS1).（六）簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)（七）cDNA第一鏈的合成。1）為準(zhǔn)備5'-和3'-RACE-ReadycDNA的合成反應(yīng)，先按照以下比例配制足夠BufferMix混合體系。多配一管反應(yīng)以保證有足夠的體積。在微量離心管中混勻各組分，并短暫離心，置于室溫條件下，直到步驟6。5XFirst-StrandBuffer4.0rLDTT(100mM)0.5rLdNTPs(20mM)1.0rLTotalVolume5.5gL2）在不同的微量離心管中混勻以下組分。準(zhǔn)備5'-RACE-ReadycDNARNA*1.0-10rL5'-CDSPrimerA1.0rLSterileH2O0-9rLTotalVolume11gL準(zhǔn)備3'-RACE-ReadycDNARNA*1.0-11uL3,-CDSPrimerA1.0uLSterileH2O0-10uLTotalVolume12gL*使用1uL小鼠心臟RNA(1ug〃L)作為對(duì)照。3)混勻各組分，并短暫離心。4)在72°C條件下溫育3min,然后在42°C條件下降溫2min。最后14,000g離心10sec。注意：此步驟在PCR儀中進(jìn)行，在孵育時(shí)，可以準(zhǔn)備步驟6的MasterMix。5)向5,-RACE反應(yīng)管中各加入1uL的SMARTerIIAoligonuleoctide，混勻后瞬時(shí)離心。6)準(zhǔn)備足夠的MasterMix以進(jìn)行5'-和3'-RACE-ReadycDNA的合成反應(yīng)。在室溫下混合以下組分：BufferMixfromStep15.5uLRNaseInhibitor(40U/uL)0.5uLSMARTScribeReverseTranscriptase(100U)2.0uLTotalVolume8.0gL7)將分別向步驟4(3,-RACEcDNA)和步驟5(5,-RACEcDNA)中變性的RNA反應(yīng)物管中加入步驟6中的8uLMasterMix混合物，每管體積均為20uL的cDNA反應(yīng)體系。8)使用槍輕柔地混勻試劑，并短暫離心。9)在PCR儀中，42°C溫育90min。70°C加熱10min終止反應(yīng)。11)用Tricine-EDTABuffer稀釋第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物：Add10uLifyoustartedwith<200ngoftotalRNA.*Add90uLifyoustartedwith>200ngoftotalRNA.*Add240rLifyoustartedwithpolyA+RNA.目的基因的拷貝數(shù)決定如何稀釋樣品。Ifyouhave200ngoftotalRNAbutyourgeneofinteresthaslowabundance,dilutewith10rL.Ifyouhave200ngoftotalRNAandthegeneofinterestishighlyabundant,dilutewith90rL.12)獲得的3'-and5'-RACE-ReadycDNA樣品在-20°C可保存最多3個(gè)月。4．RapidAmplificationofcDNAEnds(RACE)1)為準(zhǔn)備所有的PCR反應(yīng)，先按照以下比例配制足夠PCRMasterMix混合體系。多配一管反應(yīng)以保證有足夠的體積，每管相同的MasterMix都可以用于5'-和3,-RACE反應(yīng)。對(duì)于每50rL的反應(yīng)體系，具體體系如下：PCR-GradeH2O15.5rL2XSeqAmpBuffer25.0rLSeqAmpDNAPolymerase1.0rLTotalVolume41.5gL2）按下表準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系，按以下順序?qū)⒏鹘M分加入到0.5mL的PCR管中，并輕柔混勻。Component5'-or3'-RACESampleUPMonly(—control)GSPonly(—control)5'-or3'-RACE-ReadycDNA(experimental)2.5rL2.5rL2.5rL10XUPM5rL5rL5'or3'GSP(10rM)1rL1rLH2O1rL5rLMasterMix(Step1)41.5rL41.5rL41.5rLTotalVolume50gL50gL50gL3）選擇下列合適的擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Program1和Program2都能對(duì)陽性對(duì)照的5'-和3'-RACETFR和UPM引物進(jìn)行擴(kuò)增）。根據(jù)是使用polyA+mRNA還是總RNA，選擇正確的循環(huán)數(shù)。注意：①需要確定目的基因的最佳循環(huán)數(shù)，因?yàn)檠h(huán)數(shù)依賴于目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量。做20?25個(gè)循環(huán)，取5rL在1.2%的EB膠上檢測(cè)。如果條帶很弱或者沒有條帶，就將管子放回PCR儀并增加5個(gè)循環(huán)(根據(jù)三次梯度PCR的循環(huán)數(shù))。最佳的延伸溫度由目標(biāo)擴(kuò)增子的長(zhǎng)度決定；對(duì)于5?10kb的擴(kuò)增子，一般延伸10min。②Tm是根據(jù)引物的3'端(基因特異結(jié)合區(qū))，而不是整個(gè)引物。Program1(touchdownPCR—preferred;useifGSPTm>70°C)?5cycles:94°C30sec72°C3min*5cycles:94°C30sec70°C30sec72°C3min*20cycles(PolyA+RNA)OR25cycles(TotalRNA):94°C30sec68°C30sec72°C3min*Iffragments>3kbareexpected,add1minuteforeachadditional1kb.Program2(useifGSPTm=60-70°C)20cycles(PolyA+RNA)OR25cycles(TotalRNA):94°C30sec68°C30sec72°C3min*Iffragments>3kbareexpected,add1minuteforeachadditional1kb.)(可選)如果之前的PCR反應(yīng)不能產(chǎn)生目標(biāo)條帶或者不能擴(kuò)出條帶，那就需要使用UniversalPrimerShort(UPMshort)和NGSP進(jìn)行巢氏PCR。這種辦法適用于量少的轉(zhuǎn)錄本。第二次PCR獲得目的條帶的可能性更大。將5rL的第一次PCR產(chǎn)物用245rL的Tricine-EDTAbuffer稀釋。重復(fù)前面的步驟1~3，注意以下操作：.用5^L稀釋后的第一次PCR產(chǎn)物代替RACE-ReadycDNAs。.使用1^L的UniversalPrimerShor^DI^L的巢氏PCR引物GSPs。.Program2，15~20個(gè)循環(huán)。5.RACE產(chǎn)物純化A.凝膠回收，使用NuceloSpinGelandPCRClean-UpKit。實(shí)驗(yàn)開始前：把24mL的96~100%乙醇力口入至1」WashBufferNT3當(dāng)中，之后瓶蓋用標(biāo)記筆做好標(biāo)記。WashBufferNT3在室溫下(18~25°C)穩(wěn)定，至少能保存一年。1)將RACEDNA產(chǎn)物樣品在瓊脂糖/EB凝膠上進(jìn)行電泳。推薦的電泳緩沖液是TAE(40mMTris-acetate[pH8],1mMEDTA),或者是TBE(45mMTris-borate[pH8]，1mMEDTA)。2)將凝膠置于UV燈下。使用干凈的手術(shù)刀片或者剃須刀片切下可能的目的DNA條帶?？拷繕?biāo)條帶切膠以減少附近的凝膠。估計(jì)切下的切膠中的DNA含量。注意：減少UV曝光時(shí)間以減少DNA損傷。3)測(cè)量切膠的重量，把它轉(zhuǎn)移到干凈的1.5mLEP管中。4)對(duì)于100mg的凝膠，加入200RLBufferNTI。5)樣品置于50°C條件下溫育5?10min。每2~3min渦旋振蕩一次，直到切膠完全溶解。把NucleoSpinGel和PCRClean-UpColumn裝入CollectionTube(2mL)中，并加入700rL的樣品。11,000g條件下離心30sec。棄置濾液并將Column放回收集管中?？衫^續(xù)將剩余樣品力入，再重復(fù)離心操作。Column中加入700^LBufferNT3。11,000g條件下離心30sec。棄置濾液并將Column放回收集管中。11,000g條件下離心1min完全去除BufferNT3。在離心去除液體時(shí)，確定SpinColumn不沾有離下去的液體。注意：BufferNT3中的剩余乙醇可能抑制酶的活性。可以在洗脫之前(步驟9),在70°C條件下溫育2~5min以充分去除乙醇。pMD18-Tvector1rLInsertDNA0.1pmol?0.3pmoldH2Oupto5rL9）把Column轉(zhuǎn)移到新的1.5mLEP管中（不提供，自備）。加入15-30rLBufferNE并在室溫條件下（18~25℃）溫育1min。11,000g條件下離心1min收集DNA.注意：回收大片段DNA（＞1000bp）可以通過重復(fù)洗脫步驟以提高回收率，使用新的緩沖液洗脫，70°C條件下溫育5min。TA克隆實(shí)驗(yàn)：A.PCR產(chǎn)物加A尾在無菌的離心管中按照下表的體系加入各種成分：經(jīng)純化的平末端DNA片段1~7rL（0.1~1ug）10xBuffer（含MgCl2）1rLdNTP1rL（終濃度0.2mM）Taq酶（5U/rL）1rL加去離子水至終反應(yīng)體積為10rL將離心管內(nèi)容物輕輕的混勻后置于72°C保溫20?30分鐘。加A后的產(chǎn)物可以經(jīng)純化回收或直接取適量用于連接反應(yīng)。B.連接實(shí)驗(yàn)（pMD18-T）1）在微量離心管中配制下列溶液，全量為5rL。2）力口入5rL（等量）的SolutionI。3）16°C反應(yīng)30min。長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物（2kb以上）進(jìn)行DNA克隆時(shí)，連接反應(yīng)時(shí)間需延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)。C.轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（1）取-70°C凍存的感受態(tài)于冰上融化。（2）取1rL質(zhì)?；蛘?0rL連接產(chǎn)物，加入50~100rL的感受態(tài)細(xì)胞，輕柔混勻，冰浴30min（降低細(xì)胞代謝率，防止細(xì)胞大量死亡）。⑶將離心管置于42°C水浴90s（使細(xì)胞壁熱脹冷縮）；然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰浴2min（使細(xì)胞壁上粘附的DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)），該過程不要搖動(dòng)離心管。（4）吸取700Rl無抗性的LB液體培養(yǎng)基于感受態(tài)輕柔混勻，37°C搖培至菌液濃度合適（目的使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇，促進(jìn)細(xì)胞獲得新表型）（150rpm/min，1h）。⑸離心10,000g,2min棄上清至留有約100^L,混勻。（6）涂板于含抗性的LB固體平板（氨芐青霉素50陷/mL）,直至平板內(nèi)的液體被吸干，37°C倒置培養(yǎng)約12?16h。待轉(zhuǎn)化菌于氨芐青霉素抗性平板長(zhǎng)出菌落后，進(jìn)行菌落PCR和測(cè)序鑒定。具體步驟：做篩選的培養(yǎng)基用LB固體培養(yǎng)基，即100ml體系中加入1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1gNaCl、1.5g瓊脂糖。高壓滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至50°C左右，加100rL初濃度為50mg/mL的氨芐青霉素使之終濃度為50解加乙倒平板（加抗生素時(shí)溫度不要過高，否則抗生素失活，達(dá)不到篩選目的）。連接轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落做菌落PCR初鑒定，陽性克隆送去測(cè)序。D.菌落PCR（1）在0.5mLEppendorf管中依次加入：10xBuffer2.5rLrTaq0.3rLRV-M0.5rLM13-470.5rLdNTP1rLddH2O20.2rL⑵1.5mLEP管加1mlLB培養(yǎng)基。⑶每個(gè)EP管加1RLAmp（氨芐青霉素，50mg/ml）。⑷取11個(gè)0.5mlEP管，其中10個(gè)各加水20.2rL。第11管加11管的量，并分裝其它10管，包括10xBuffer27.5rL、RV-M5.5rL、M13-475.5rL、dNTP11rL。分裝到其余各管，每管4.5rL，最后每管補(bǔ)足rTaq0.3rL（PCR體系與LB（A+）一一對(duì)應(yīng)）。⑸挑單菌落。10rL槍挑菌落后，先在0.5mlEP管中沾兩下，再到LB中吹打。（6）菌落PCR。單菌落37°C搖菌，200rpm，3~4h。⑺1%的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌落PCR結(jié)果。反應(yīng)條件：TOC\o"1-5"\h\z95°C5min94°C1min55°C1min72°C1.5min30個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸10min。⑻取500匹菌液用于測(cè)序確認(rèn)重組子及測(cè)序是否正確另500比菌液4°C保存，待測(cè)序結(jié)果分析后，確認(rèn)是否進(jìn)行后續(xù)操作。E.RACE產(chǎn)物構(gòu)建重組載體，使用In-FusionHDCloningkit。In-Fusion克隆試劑配制：LineareizedpRACEvector(providedwithSMARTerRACE5'/3'KitComponents)1rLGel-purifiedRACEproduct(SectionVII.A,Step9)7rLIn-FusionHDMasterMix2rLTotalVolume10gL50°C溫育15min，再轉(zhuǎn)移到冰上。3）取-70°C凍存的感受態(tài)于冰上融化。4）感受態(tài)融化后，分裝50rL感受態(tài)細(xì)胞到新的1.5mLEP管中。期間不能搖晃EP管。5）用感受態(tài)細(xì)胞StellarCompetentCells轉(zhuǎn)化2.5rL的In-Fusion反應(yīng)產(chǎn)物，輕柔混勻，冰浴30min。要點(diǎn)：不能加入超過5rL的反應(yīng)物加入到50rL的感受態(tài)細(xì)胞中。加入過多的反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)抑制轉(zhuǎn)化過程。6）將離心管置于42°C水浴60s；然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰浴2min，該過程不要搖動(dòng)離心管。7）吸取500M無抗性的SOC液體培養(yǎng)基（事先預(yù)熱至37°C）于感受態(tài)輕柔混勻，37°C搖培至菌液濃度合適（160~225rpm/min，1h）。8）離心10,000g，2min棄上清至留有約100^L，混勻。9）涂板于含抗性的LB固體平板（IPTG-X-gal平板），直至平板內(nèi)的液體被吸干，37°C倒置培養(yǎng)約12~16h。10）第二天，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)平板上挑取單菌落。使用試劑盒提取質(zhì)粒DNA。為了證明是否成功插入RACE序列，可以通過PCR篩選（使用GSPs引物）或者限制性酶切（使用克隆位點(diǎn)側(cè)翼的EcoRIandHindlll）。注意：對(duì)于5'-RACE產(chǎn)物，建議挑取8?10種不同的單菌落以獲得最大長(zhǎng)度的5’末端（詳見全長(zhǎng)cDNA的注意事項(xiàng)，C部分）。2．IPTG-X-gal平板制作IPTG儲(chǔ)液配置：一般將IPTG配成20%（m/V）（約0.84M）的母液。稱取0.5克IPTG粉末，用2ml蒸餾水將其完全溶解后，補(bǔ)加蒸餾水至2.5mL，用孔徑0.2211m的小型注射型過濾器（預(yù)先裝好濾膜滅菌備用）過濾除菌，-20°C凍存。X-gal儲(chǔ)液配置：用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/mL的貯存液。稱取0.2gX-gal，加入10ml二甲基甲酰胺（DMF），溶解后保存于一小血清瓶?jī)?nèi)，裝有X-gal溶液的血清瓶須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應(yīng)貯存于-20°C。X-gal溶液無須過濾除菌。IPTG-X-gal平板制備：在含氨芐或卡那抗生素平板上，滴加40pL的X-gal儲(chǔ)液及5pL的IPTG儲(chǔ)液（怕體積過小影響涂布均勻，可適當(dāng)稀釋后再涂奄，涂布均勻后晾干后使用。在臨使用前提前1h制備。注：也可以將X-gal儲(chǔ)液（40pL）及IPTG儲(chǔ)液（5pL）加入到將要用于涂板的100pL的細(xì)菌懸液里，混勻后直接涂平板可以。4）當(dāng)長(zhǎng)出菌落后，如果藍(lán)白斑還不夠明顯，可以放置于4°C冰箱里一段時(shí)間，待藍(lán)白斑明顯后，再挑去白色菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)。C.RACE產(chǎn)物測(cè)序一旦確定克隆中含有最長(zhǎng)的特異性的插入片段，就要盡可能地獲得更多的序列信息。最好的情況是能夠獲得整個(gè)開放閱讀框，包括5’和3’端的非轉(zhuǎn)錄區(qū)域。注意：1）提供的pRACE載體是基于pUC19的載體，里面融合了M13測(cè)序引物以確定插入序列。因?yàn)镮n-Fusioncloning具有方向性，因此可以優(yōu)先選擇M13F引物測(cè)序到UPM末端，以及M13R測(cè)序到基于特異性末端。UPM包含了T7引發(fā)位點(diǎn)，可以用于Sanger測(cè)序，但是推薦使用M13引物以完整準(zhǔn)確地讀取測(cè)定的序列。T7引發(fā)位點(diǎn)與5'-和3'-端的克隆位點(diǎn)非常近，可以在跟蹤測(cè)序時(shí)確定是否完全覆蓋。2）有關(guān)全長(zhǎng)cDNA。沒有任何cDNA合成方法可以確保獲得整個(gè)全長(zhǎng)cDNA，特別是5'末端。確定真正的5'末端需要結(jié)合一些RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)，引物延伸實(shí)驗(yàn)，以及cDNA或者基因組序列信息。許多SMARTerRACEcDNAs包括了cDNA完整的5'末端；但是在一些情況下，嚴(yán)格的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)阻礙RT酶和/或SeqAmpDNAPolymerase的活性。通常情況下，如果cDNA是通過常規(guī)的RACE方法獲得或者來源于文庫，SMARTerRACE產(chǎn)物和全長(zhǎng)cDNAs相差無幾。3）有關(guān)獲得cDNA全長(zhǎng)的方法。在RACE產(chǎn)物已經(jīng)被部分或者全部測(cè)序之后，就可以通過以下兩種方法獲得全長(zhǎng)cDNA：LongdistancePCR（LDPCR），根據(jù)cDNA的5'和3'末端的最邊緣序列設(shè)計(jì)引物，并使用5'-RACE-ReadycDNA作為模板。通過重疊區(qū)域的限制性位點(diǎn)，克隆重疊的5'-和3'-RACE片段（如果可行）。如果沒有合適的限制性位點(diǎn)，也可以通過設(shè)計(jì)新的GSPs引物以進(jìn)行多序列的In-Fusioncloning一般來說，LDPCR方法更直接，并且更少受到其它并發(fā)和人為因素的影響。通過克隆，它可能結(jié)合到兩個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本的5'和3'cDNA片段；這可能發(fā)生，如果是polymorphicRNA的兩個(gè)不同形態(tài)或者是一個(gè)多基因家族的轉(zhuǎn)錄本。與此相比，端到端的聚合酶鏈反應(yīng)，5'and3’末端引物能夠擴(kuò)增單一的cDNA鏈，不會(huì)產(chǎn)生其它擴(kuò)增。幾乎所有的cDNA都能通過LDPCR獲得。如果要用克隆的RACE產(chǎn)物做進(jìn)一步分析，建議使用SeqAmpDNAPolymerase以及In-FusionHDCloning方法獲得全長(zhǎng)。3.RACE故障排除指南A.梯度PCR故障排除首先修改最后的循環(huán)數(shù)（20?25循環(huán)，退火溫度68°C）。如果在68℃條件下的最小循環(huán)數(shù)，還看到?jīng)]有任何擴(kuò)增產(chǎn)物，把產(chǎn)物放回PCR儀，多做5個(gè)循環(huán)。如果產(chǎn)物還是沒有出現(xiàn)，在68℃繼續(xù)增加3?5個(gè)循環(huán)。如果還不成功，則重新做一個(gè)反應(yīng)，在68℃到65°C之間，改變退火溫度，設(shè)定三套循環(huán)。如果GSP引物的退火溫度接近70°C，最后一套方案最有效。如果增加循環(huán)數(shù)不能解決問題，可嘗試用更少的Tricine-EDTAbuffer來稀釋模板，增加RACE模板濃度。RACEPCR陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：進(jìn)行cDNA第一鏈擴(kuò)增時(shí)，用老鼠心臟總RNA進(jìn)行陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，使用5'-或者3'-RACETFR引物。對(duì)照PCR反應(yīng)（當(dāng)RACE反應(yīng)結(jié)果并不是最佳時(shí)）：對(duì)照反應(yīng)1：使用兩條GSP引物擴(kuò)增5'-和3'-RACE片段之間的重疊區(qū)域（如果可以的情況下），看是否獲得單一條帶。對(duì)照反應(yīng)2：使用UPM引物擴(kuò)增cDNA作為陰性反應(yīng)。小于40個(gè)循環(huán)應(yīng)當(dāng)不出現(xiàn)條帶。對(duì)照反應(yīng)3（如果是做小鼠RNA）：5'-or3'-RACEPCR使用TFR引物，UPM引物組合，5'-和3'-RACE-ReadycDNA來自實(shí)驗(yàn)的小鼠RNA.。對(duì)照反應(yīng)4：使用GSP引物本身進(jìn)行擴(kuò)增作為陰性反應(yīng)?？匆锸欠裼袉栴}。如果對(duì)照反應(yīng)正常，但是樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍不正常，那么返回檢查RNA樣品的產(chǎn)量和質(zhì)量。RNA中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量如果太少將會(huì)很難擴(kuò)增出來。RACE產(chǎn)物有許多（Multiple）條帶“真的"MultipleRACEProducts的來源根本原因：不同基因能產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)錄本。?選擇性剪切。不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。不同的多聚腺苷酸化位點(diǎn)。另外，目的基因可能屬于一個(gè)多基因家族，因此“gene-specific”primers可能會(huì)同時(shí)擴(kuò)增一些高度同源的cDNA。不需要去區(qū)分RNA的多態(tài)型（polymorphicform），目標(biāo)是從中找到信息最多的RNA結(jié)構(gòu)。2）人為因素產(chǎn)生的假的條帶不完整的RNA片段。RNA降解導(dǎo)致引物的非特異性結(jié)合。通常來說，降解的RNA導(dǎo)致5'-RACE產(chǎn)物多。非特異性RACE產(chǎn)物。引物在dscDNA上多位點(diǎn)的非特異性結(jié)合，以及引物二聚體。3）故障排除一RACE產(chǎn)物有許多（Multiple）條帶進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增。如果不能解決，則按照以下操作解決：如果沒做對(duì)照，則重做RACE實(shí)驗(yàn)并帶上對(duì)照實(shí)驗(yàn)。尤其GSP引物單獨(dú)擴(kuò)增不能有產(chǎn)物。如果有擴(kuò)增，則改變參數(shù)或進(jìn)行巢氏PCE，同時(shí)陽性對(duì)照的RACE實(shí)驗(yàn)也要相應(yīng)調(diào)整。使用5也的5~10倍稀釋的RACE-ReadycDNA，再次進(jìn)行反應(yīng)。如果之前沒有檢查起始RNA的大小分布，則要重新檢查一下。如果小于預(yù)期，則重新純化RNA。如果許多條帶存在，嘗試設(shè)計(jì)一套新引物：.Tm值大于70°C（基于引物的gene-specificend）。.建議新設(shè)計(jì)引物的RACE產(chǎn)物與之前引物的大小不同。.做巢氏PCR之前，使用UPM與GSP1或者NGSP1分別進(jìn)行擴(kuò)增。如果Multiplebands是真的（正確引物的擴(kuò)增產(chǎn)物），那么巢氏PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)該更小。?如果許多條帶存在，嘗試改變PCR循環(huán)參數(shù)：.通過提高退火溫度2-5°C，提高PCR的嚴(yán)謹(jǐn)度（Stringency）。.減少循環(huán)數(shù)。.減少延伸時(shí)間。.在擴(kuò)增大片段的RACE產(chǎn)物時(shí)，增加延伸時(shí)間可能消除雜帶。如果這些方法都不能改善RACE反應(yīng)結(jié)果，那么問題就很可能是RNA的質(zhì)量不好。C.其它特殊問題

ProblemPossibleExplanationSolutionUsingyourexperimentalcDNAsample,no5'-or3'-RACEbandsareproduced,butthepositivecontrolRACEreactionsgivetheexpectedproducts.YourgenemaynotbeabundantinyourRNAsample.Perform5morePCRcyclesatthe68°Cannealingtemperature.RepeattheseadditionalcyclesuntilyourRACEfragmentsappear,butdonotexceed50cyclesfortouchdownPCRor40cyclesfornon-touchdownPCR.Ifyoustillfailtoproducetheexpectedproducts,youmayhavetofindanewsourceofRNAinwhichyourgeneismoreabundant.Theannealingtemperatureistoohighforyourprimers.Lowertheannealingtemperaturebyincrementsof2°C.YourprimersarenotsuitableforPCR.CheckyourprimersagainstthecriteriainSectionIV,anddesignnewonesifnecessary.Extensivesecondarystructureand/orhighGC-contentpreventanefficientamplificationofyourgeneofinterest.TryredesigningyourprimersclosertotheendsofthecDNA,ortrytoavoidGC-richregionsiftheyareknow.RACEcDNAproductissmeared.NOTE:SomeSMARTerRACEreactionsproduceverycomplexpatternsofbandsthatappearalmostassmears.Inmostcasesoftruesmearing,aproblemhasoccurredpriortotheRACEreaction,especiallyifthe3'-RACEreactionproducesasmear.Inthesecaseswerecommendrepeatingtheentireprocedureafterre-purifyingyourRNA(orconfirmingth