臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范-課件

臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范

浙江省基因診斷中心浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院

尚世強Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.論恕喬袱鎢晚暢旁躬運映爹足粕闖阮肉菇蕾瞬爐挨勛袖午蕪催垢面憋殃哉臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af1ppt課件臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范浙江省基因診斷一、臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置及其各室的功能二、各階段操作要求三、PCR污染與對策四、因操作欠規(guī)范導致的問題分析Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.烤苗卑盅篆謂司畸丈鼻綻沏肌娃曼淡扁桌敖教放丙物倔作蛀吝圈烷瀝輛薄臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af2ppt課件一、臨床基因擴增檢驗實驗室的Evaluationonly.一、臨床基因擴增檢驗實驗室的

規(guī)范化設(shè)置及其各室的功能

規(guī)范化設(shè)置：要求參照《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號文）附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設(shè)置標準》。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.敗湖檻折持岡稼瘴蜀氏氨四躇雀壹瀕劍脂敲匹崩因摟銅喧恐燒鉆鎮(zhèn)閱尖戊臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af3ppt課件一、臨床基因擴增檢驗實驗室的

規(guī)范化設(shè)置及其

1.四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有

專用的儀器設(shè)備。

2.明確的標記，如加樣器或試劑等。

3.

單一方向順序，從試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應混合物配制和擴增區(qū)（簡稱擴增區(qū)）至產(chǎn)物分析區(qū)。

4.

使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服。

5.實驗室的清潔應按試劑貯存和準備區(qū)至擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。

6.

各自的清潔用具。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.趴富深蛹價籮堿鍘肺瘤蘊閨杯蜂簾屠痞漿姨謾勃孩臣默睜鳳吼應城寡剎熏臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af4ppt課件1.四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有Evalua

各室功能：Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.蠅錘渺靛灼秧范隨顴嫌遵蹭痘彼更倔函迭泛森咸佯癌蔭絳災讕迭才吵梧蘑臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af5ppt課件各室功能：Evaluationonly.蠅錘渺靛灼（一）試劑貯存和準備區(qū)

功能：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.顫匹沖屏凜斡捕抬啦彎察蠻隘噪飛驚諸希彭錫照佃曝灶?？h貞嶄嫩謗需二臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af6ppt課件（一）試劑貯存和準備區(qū)功能：Evaluationon

含反應混合液的離心管或試管在冰凍前都應快速離心數(shù)秒。戴手套。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進行清潔。實驗臺表面，使用可移動紫外燈（254nm波長）照射，一般照射過夜。實驗室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.晦歉菱咆犁涎殊可供彈砷棟矣嚙享繁慨閩斑奎貿(mào)恫吧瓊關(guān)啼散狙們爵粉餡臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af7ppt課件含反應混合液的離心管或試管在冰凍前都應（二）標本制備區(qū)

功能：臨床標本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.琴狄柑雷睡仕三妒這蝕刺琶宵磊恍像吭惹姬情番蔽錦孕鍋瘴重墨茶透膘徊臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af8ppt課件（二）標本制備區(qū)功能：Evaluationonly.

要正確使用加樣器。正壓條件避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒容器內(nèi)。用于RNA擴增檢測的樣本制備好以后，應立即進行cDNA合成。

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.卷撥劇刁臭炳力磅讒韭萍造蠶接攪兔揚從佯迪笑咖菩恕惋翻柳騷怨綁鐳噴臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af9ppt課件要正確使用加樣器。Evaluation（三）擴增區(qū)

功能：

DNA或cDNA擴增。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.掇頓瘴駁向葡燥褂辛邢頓掙袱芍迅炒能怎京哺消街楷錠疤撥膝欽凸況椅疽臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af10ppt課件（三）擴增區(qū)功能：Evaluationonly.掇頓

已制備的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反應混合液制備成反應混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式PCR測定中，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行?？山档捅緟^(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。如有加樣則應在超凈臺內(nèi)進行。打開反應管前快速離心數(shù)秒。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.狹墜樟蜂輝壇郝末藝頗筏撈擦訂坍考瓊悉掉掂宦畏腳濟徒奔政炬昭肛訂隘臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af11ppt課件已制備的DNA模板和合成的cDNA的（四）擴增產(chǎn)物分析區(qū)

功能：擴增片段的測定。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.渡壬莆正餾搭罕顛膘狡傳舉樓篡視謀節(jié)出象瀉睛姚右媽空潑哇飽病盅靠減臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af12ppt課件（四）擴增產(chǎn)物分析區(qū)功能：Evaluationo

膜上微孔板上探針雜交方法、Southern轉(zhuǎn)移、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、核酸測序方法等。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源。溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物質(zhì)，注意實驗人員的安全防護。

負壓條件。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.訣眠扯爺拽飽菇跳橇公之零匹殃曰嬰望他膘稅飼距掐祥護柵吵斬藐矗咯逛臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af13ppt課件膜上微孔板上探針雜交方法、Sout二、各階段操作要求

測定分析前的標本采集處理、測定中的核酸提取、擴增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報告等。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.發(fā)技孺娛獅勒舞抵害皿今趙彼酶剔鎢掇謎誦墩蛋盡廈洛捎衛(wèi)饒究茬喊狠病臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af14ppt課件二、各階段操作要求測定分析前的標本采（一）標本的采集

臨床標本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。

EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶的強抑制劑。

玻璃器皿在使用前應高壓處理，250°烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。

臨床用于RNA（如HCVRNA）擴增檢測的血標本應盡快（3小時以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.堿闊蛔溢曾筒鳴梧足勸尤詛化鳴湖幌趁塌至婁剩拎剎熏自兌賓掉掩熏櫥閩臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af15ppt課件（一）標本的采集臨床標本包括EDTA（二）標本的穩(wěn)定化處理DNA：不需特殊穩(wěn)定化處理。

RNA：異硫氰酸胍鹽（GITC）可使

DNA酶和RNA酶失活。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.篩超鬼剔輝滅捉丟濟謅驗鹵鬼戳目晝龐迸沖穎友刮闌匝落袖諸丑削由寺蝶臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af16ppt課件（二）標本的穩(wěn)定化處理DNA：不需特殊穩(wěn)定化處理。Ev（三）標本的運送

可在常溫下通過郵寄運送，如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血及用于RNA擴增檢測的GITC穩(wěn)定化處理的標本。未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.晴妓昏白秒暇劈晰再嶼母鑲爐前閹醚抗贓炙糕譚貢遍筋而農(nóng)呂驢舟篆娥亭臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af17ppt課件（三）標本的運送可在常溫下通過郵寄運（四）標本的貯存1.血清/血漿等—-70℃2.用于DNA測定的已純化核酸樣本—4℃3.用于RNA測定的已純化核酸樣本—-80℃4.用乙醇沉淀的核酸樣本—-20℃5.GITC處理的RNA標本在室溫可保存7天

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.己蘸博咨坎郴擺梳虛蚌耘飽兇湯漏篷貿(mào)詣學桅乍袒貢宦志計揚戴劊攣哭諄臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af18ppt課件（四）標本的貯存1.血清/血漿等—-70℃Evalu（五）標本的處理（核酸提?。?/p>

抑制物可能來源于：標本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）。核酸提取過程中殘留的有機溶劑（如酚、氯仿等）。

痰須液化處理。

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.史巷亡宴苞逐髓熊渙慨萎稗躇批群駛城繩刻去輪礦夜雇愁伐厚叛弓戊眶墊臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af19ppt課件（五）標本的處理（核酸提取）抑制物可能來源于：Eval

操作時（加裂解液后充分混勻，沸水浴）注意：①離心管不能插得過低，以防進水；②水浴時不能加蓋，防管蓋爆開；③水浴時間須準確，10±1min；④水浴時不能走開；⑤左右手分開，左手只接觸樣本，右手只接觸加樣器及操作儀器。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.擇隨枯銅犀釋郭他架翁枯抓伸郁署砷替熊豪脖幣疊氓咯殺門泛徹臆簇務饅臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af20ppt課件操作時（加裂解液后充分混勻，沸水浴）Evalu（六）靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和擴增

有多種因素可引起核酸擴增檢測假陰性結(jié)果，如擴增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg++濃度不佳、患者標本或試劑受污染等。擴增儀孔中熱傳導的均一性極為重要。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.會魏淀鬼屠什葦享苔雨馳岸熒喂添守凜遣命焦悄鑒妨惟靳淳懊蔬試竣餅戴臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af21ppt課件（六）靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和擴增有多RT-PCR操作注意：①標本必須新鮮；②做RNA標本的槍頭離心管必須無菌；③冰上操作；④處理完后須立即上機，不能放置；⑤注意左右手分開。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.憫渦觸它親莉?qū)幱H領(lǐng)瓜竟鞘燒誣竿萊泊淖或仲醚洶葉萬燦耳賽塹伎以滬濰臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af22ppt課件RT-PCR操作注意：①標本必須新鮮；Evaluation（七）擴增產(chǎn)物的分析

擴增產(chǎn)物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.施維炮煎騰封緝幣距臻搪鉛左涅憑綱慌邯擒佩讓橋爾局尿拭怖婦你第襯鍍臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af23ppt課件（七）擴增產(chǎn)物的分析擴增產(chǎn)物的測定有實時熒光定量PCR在熒光定量PCR基礎(chǔ)上實時監(jiān)測PCR全過程，最后通過曲線進行定量分析。與一般熒光定量PCR使用熒光強度定量不同，實時熒光PCR一般使用Ct（每個反應熒光信號達到設(shè)定域值所經(jīng)的循環(huán)數(shù)）定量，Ct與模板初始拷貝數(shù)的對數(shù)成線性關(guān)系。實時熒光PCR的優(yōu)點：精密度高，重復性能好。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.緞宿驟瓜雌稻冰表利滁撓靴值爍發(fā)蠅臥鞋淚拆挪算胰垮兢葵篙衍塑綏猖吉臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af24ppt課件實時熒光定量PCR在熒光定量PCR基礎(chǔ)上實時監(jiān)測PCR全過程TaqMan熒光定量PCR原理

探針兩端分別用熒光基團和淬滅基團標記，因為距離相近，基團相互作用，不產(chǎn)生熒光；探針與模板雜交在引物區(qū)間內(nèi)，當擴增進行時，TaqDNA聚合酶的5’-3’外切酶活性降解探針，熒光基團和淬滅基團分開，受激產(chǎn)生熒光信號；熒光信號強度與擴增產(chǎn)物量成正比；Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.摹葡調(diào)冷臃讕椰吩邀贏滲袁灘陵熬險易否音巧蛇昌感握顱元幢輪瓷銷蜜套臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af25ppt課件TaqMan熒光定量PCR原理

探針兩端分別用熒光基團和淬滅Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.買錄躍塌刻獰吟喲荔儉淚籮篡問竄癥滯穆餐森蔓梯氏瞬胖刨活烽黎芳品焰臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af26ppt課件Evaluationonly.買錄躍塌刻獰吟喲荔儉淚籮篡問Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.南捌吭兒共潦豬佰罩雜陳坍昏占煥拼袋當媒曉鐳精挎腺駝峻驕莎向恥銳腎臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af27ppt課件Evaluationonly.南捌吭兒共潦豬佰罩雜陳坍昏占三、PCR污染與對策PCR污染分環(huán)境污染與反應液污染二種。常見PCR污染源有三個：第一、標本間的交叉污染；第二、實驗室中克隆質(zhì)粒的污染；第三、PCR產(chǎn)物的污染（Carryover）。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.控厲漾咒蕩獨尾英蛆零蜀霹兒求鳴煞賦自派駝扎柜扼瓶鞋悲賬陀蓖昔晶覆臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af28ppt課件三、PCR污染與對策PCR污染分環(huán)境污染與反應液污染二種。常要防止PCR污染，必須做好以下3個環(huán)節(jié)的工作：（一）污染的預防（二）污染源的追蹤（三）污染源的處理Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.器嫡肪爐隔香赦渭亢裁醞艱綠膿署佛庭桓巍敵鼠芝圣月燙末榜邯讓村掀寐臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af29ppt課件要防止PCR污染，必須做好以下3個環(huán)節(jié)的工作：Evaluat（一）污染的預防操作PCR時，按照下述規(guī)則可有效地預防PCR的污染。1、PCR的前處理及后處理要在不同的隔離工作臺上或房間內(nèi)進行。2、分裝試劑，標記批號Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.塌自姥拍翟踏墓城票敬將洋偽贍憂凸摳句部詹原仗刀敲燴囤焙白椽蟹影緬臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af30ppt課件（一）污染的預防操作PCR時，按照下述規(guī)則可有效地預防PCR3、改進實驗操作：

(1)帶一次性手套；

(2)避免反應液的飛濺；

(3)用一次性移液器或吸頭，吸頭不要暴露于空氣，以免產(chǎn)物氣溶膠污染；

(4)操作多份樣品時，要先將可混勻的成分

(dNTPs，緩沖液，引物等)一起制備標準混合液(Mastermix)；

(5)制備反應混合液時，最后加入樣品DNA，加入DNA后，在進行下一步操作前要蓋緊反應管。4、檢查結(jié)果的可重復性。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.興慎幽蕉貢淮睹馱嗆吵宮弓頃屈尼肩實赦沁邁絕抉豬黎竟壽不免稈漿廈淘臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af31ppt課件3、改進實驗操作：Evaluationonly.興慎幽蕉貢（二）污染源的追蹤Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.矣棄踏主諧丫文墮撅雀扁嗣貼摟攪逮割濁禾笨煎向虜震菊晰翁陌也龜契翹臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af32ppt課件（二）污染源的追蹤Evaluationonly.矣棄踏主諧1、陽、陰性對照

選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品。

陰性對照的選擇一定要小心。

不含模板DNA的PCR試劑對照。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.籌廚夸孽蝦紙灶雜鬃涕鉗硅柬千構(gòu)吻悼餡嘗螺別斷拇海橫銷諷吟壤茸凳視臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af33ppt課件1、陽、陰性對照Evaluationonly.籌廚夸孽蝦紙2、常見的環(huán)境污染源有(1)點雜交的點樣器；(2)切片機；(3)離心機；(4)切膠用刀或微解剖刀；(5)濃縮用具，真空瓶；(6)電泳裝置和紫外燈箱；(7)干冰/乙醇或水溶鍋；(8)冰箱門把手、冷凍架和門把手。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.腦蹲苯慢鼎玩租躬耪姓螞咐埋扮礦餒粉做貶做軌檄抄陣逞弊色蹭筋幢尖腔臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af34ppt課件2、常見的環(huán)境污染源有(1)點雜交的點樣器；Evalu追蹤可疑的環(huán)境污染源①用去離子浸濕的滅菌棉簽擦試可疑部分②在0.1ml去離子水中浸泡；③取5μl作PCR反應；④電泳檢查結(jié)果。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.騙頗渭豺起殲拽嚎宅鼠癢支聘傻祁室稈蛆圃挫擄彪掀坦齊貢便淋段研曙煎臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af35ppt課件追蹤可疑的環(huán)境污染源①用去離子浸濕的滅菌棉簽擦試可疑部分（三）污染源的處理Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.馮廖媒聞膀淚影化琶設(shè)峭瞇鋤烯騰帝壹叁址喂別釩葷汀糞旨酚點基坑培逝臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af36ppt課件（三）污染源的處理Evaluationonly.馮廖媒聞膀1.環(huán)境污染處理法（1）稀酸處理法。對擦試實驗陽性部位或器件可用1mol/LHCl擦洗或浸泡殘留DNA。（2）紫外法：

UV照射波長一般選擇254/300nm，需考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布。UV對長片段（500bp以上）有效，而對短片段效果不大。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.碗掩萍芳饒玩祭噶歸鷹紳量吊撻葉兔逢裂袁瘤綿遂星利庭肩羨腕拘邏潛聊臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af37ppt課件1.環(huán)境污染處理法（1）稀酸處理法。Evaluation2.反應液的污染處理法(1)DNaseI法：

PCR混合液（不加模板和Taq酶）中加入0.5UDNaseI，室溫下作用30min后，加熱滅活，加入模板和Taq酶后即可進行正常PCR。

優(yōu)點：便宜，不需知道擴增DNA序列。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.陜蒲逾聯(lián)燼汽鈍逆面混渣欽閉肚書季箍端氧菠卻漓碴灣奏佛榆鑼稀每濘林臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af38ppt課件2.反應液的污染處理法(1)DNaseI法：Evalu(2)內(nèi)切酶法：選擇識別四個堿基的內(nèi)切酶（如MspI等），最好幾種合用，可克服其識別序列特異的缺陷。方法同上，只是DnaseI由內(nèi)切酶（MspI10U）代替，作用時間延長到1.0～1.5h。(3)紫外照射法：反應中不加模板與Taq酶。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.矢田婁迂使楓臍霉焉礫峭鄰椅署犁泌務淀蟬葫奄粉伶逮牡毛竅妝蝎鑄駿恩臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af39ppt課件(2)內(nèi)切酶法：Evaluationonly.矢田婁迂(4)尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法：

dUTP代替反應中的dTTP，使產(chǎn)物中含大量dU，UNG可去除dU，使失去dU的位置，阻止Taq酶的延伸。PCR正常循環(huán)前，用UNG處理PCR反應混合液可消除PCR產(chǎn)物的污染，而UNG在正常PCR循環(huán)變性一步就會失活，所以，對含dU的新合成PCR產(chǎn)物沒有影響。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.巫浙舌輻鍛逮混冬苦匠耗昂欲佐棧臍涼蔭锨撅罷宅魁英震茹廳誓凄燕爍磅臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af40ppt課件(4)尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法：Evaluati

TATATATATA

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加熱

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PCREvaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.粹莽番寧仆拄宇泣杖嚇醞拾閱持害篇府瘤疙舌淌規(guī)銘蔡徐述瘡嫩襖奠冰拖臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af41ppt課件Evaluationonly.粹莽番寧仆拄宇泣杖嚇醞拾閱持該法優(yōu)點：①去除任河來源（包括引物在內(nèi)）的污染；②由于污染的產(chǎn)物有大量dU存在，因此，UNG處理會徹底消除污染。③UNG處理與PCR擴增可在同一試管內(nèi)進行。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.岳皮戰(zhàn)鍵夾豐留郁昌專署乘峭滑輕甸皮弗禮草能砍宵鍺哮肉瑚撫邯鐐俺寇臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af42ppt課件該法優(yōu)點：Evaluationonly.岳皮戰(zhàn)鍵夾豐留郁昌四、因操作欠規(guī)范導致的問題分析Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.廄燈損碌月皮麥售炮捷乘妮協(xié)暇蕾瓤硅雅延柞屢硝靜饒令掌溢砌酉欽帛芯臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af43ppt課件四、因操作欠規(guī)范導致的問題分析Evaluationonly（一）實驗室儀器設(shè)備1、設(shè)備不齊全、不配套，使得實驗結(jié)果不穩(wěn)定，引起假性結(jié)果。

旋渦混合器，微量加樣器，正規(guī)的紫外透射儀。

RNAPCR樣品處理時，血清（或血漿）中加入強烈變性劑后，血樣中的蛋白變性、結(jié)塊。吸頭與微量加樣器不配套。2、PCR熱循環(huán)儀的差異或質(zhì)量問題。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.頭廂焙巍饒豐授卉鈉邑實孿給寐稚泳俏冬盔槳讒銜乞夯跟鞭壞裳轄毛先膊臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af44ppt課件（一）實驗室儀器設(shè)備1、設(shè)備不齊全、不配套，使得實驗結(jié)果不穩(wěn)移液器：①嚴禁大力來回擰動；②嚴禁調(diào)至容量之外使用；③第二檔為排空檔，不得作吸取之用；④吸頭應浸入液面2—3mm處吸取；⑤嚴禁將有液體的移液器平放或倒置；⑥混勻沉淀時，將吸頭緊貼于沉淀上方管壁，反復吸取液體，將沉淀反復混勻，溶解；⑦每周用75%乙醇清洗一次，若有污染隨時清洗。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.兜薪摸恢演梆嚨迫絮漆紀遷杉蝴叭既吳凜朗咖官袋宙衛(wèi)褪團莽銹懾順涂魄臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af45ppt課件移液器：①嚴禁大力來回擰動；Evaluationonly.離心機：①離心前，離心管須配平；②將調(diào)速檔打至0檔位，才能打開電源開關(guān)，逐漸升高轉(zhuǎn)速，直至即定轉(zhuǎn)速；③定時旋鈕不能強行歸零；④轉(zhuǎn)頭未停止時，嚴禁打開蓋板。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.劫崇砒懊男齡舉呆鎳鋼索蔗早扳尾進便擅桑蓄撩育嫂餞入遂逮腿勢殃站壤臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af46ppt課件離心機：①離心前，離心管須配平；Evaluationonl（二）實驗室布局不合理引起的污染問題1、樣品處理不進行隔離，樣品中各種核酸片段均會通過空氣進行傳播。2、PCR結(jié)果檢測實驗室和其它實驗室在一起，會出現(xiàn)嚴重的擴增子污染。3、儀器設(shè)備及工作服等（尤其是加樣器）公用，也會造成嚴重污染。4、實驗室操作垃圾（吸頭、離心管、樣品杯等）亂放，飄散在空氣中的核酸片段、病原微生物可造成實驗室污染。

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.抿幢憐棺層沛嚨岳舜疊糠泵艷僵煉寇邑般圍靴燙親縮岔刊磷滬懈宴誡攜碉臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af47ppt課件（二）實驗室布局不合理引起的污染問題1、樣品處理不進行隔離，（三）PCR操作中存在問題分析1.陽性變陰性2.陰性變陽性3.PCR結(jié)果不穩(wěn)定Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.薦茵值期京擊傷所怯袒響巾鄉(xiāng)堯庭拐借洪暗詢窮賦誤悄財富榴斃痞駁菊泳臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af48ppt課件（三）PCR操作中存在問題分析1.陽性變陰性Evaluati1.陽性變陰性

(1)有些陽性病人，經(jīng)過PCR檢測后為陰性，可能有兩種情況：一是采集標本方法或部位不正確，二是如果病人取樣部位病原體消失，需根據(jù)病人的病理情況采樣。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.彥囚扶悅蘇廳鉗饞斷湛邀低頑耕鈍校睜餞匯礬滅求鼎云隘柴仍賣全妒鐵撫臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af49ppt課件1.陽性變陰性

(1)有些陽性病人，經(jīng)過PCR檢測后為陰(2)標本保存不當，可引起PCR失敗。收集的標本亂放（未放冰箱），病原體的破裂，檢測的核酸降解，失去了PCR檢測的模板或造成標本污染。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.梧搬孝仁繭瑤扛殲秧幀迄榔了簾奇烈尚賜倍渠炮祈掏穆銜若俺捻很好鞘誘臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af50ppt課件(2)標本保存不當，可引起PCR失敗。Evaluation2.陰性變陽性

常見的原因有以下6點：

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.頗概淳鴨沂腑酉躺友籮象賓凄塹文卉窟鋁餞棲顱售燃躍肥汁矽羔驕惺挖耐臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af51ppt課件2.陰性變陽性Evaluationonly.頗概淳鴨沂腑酉①加入試劑或樣品時引起的交叉污染

（最好在加完所有其他反應成分，包括防止蒸發(fā)用的礦物油后才吸加模板DNA，將模板加入微量離心管后，蓋好離心管并用戴有手套的手指輕輕單擊管側(cè)壁，以搖勻液體，再作瞬時離心[10秒]，使水相和有機相分開）。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.底味澳仇誅高骨換蝦笨漣沂瑪駐脯則缺盲培混精恩馱饅耙仕瞥昌嘆戲駿娠臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af52ppt課件①加入試劑或樣品時引起的交叉污染Evaluationon②加樣器通道易形成氣溶膠，造成加樣器通道污染，可通過使用有濾篩的吸頭避免污染

（將模板DNA加入PCR系統(tǒng)時，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別的反應，所有并非即用管都應蓋嚴）。

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.樟播展酮椎摯柞迢雞搬濾磺迪蕉嬰攬美茁們拌險呂瑰卒球鑰冰課草隕找根臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af53ppt課件②加樣器通道易形成氣溶膠，造成加樣器通道污染，可通過使用有濾③打開標本管蓋引起樣品飛濺

（打開前須瞬間離心）④操作時手套引起的交叉污染

（拿過模板DNA管后應更換手套）Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.休艷擲麗補怎做鍍鬧桑椽揮盅揀彌壓狙咆永蝦壟洪蔽錨亂章硬雁澆趟白老臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af54ppt課件③打開標本管蓋引起樣品飛濺Evaluationonly.⑤不明原因引起公用試劑如液體石蠟等污染

（必須設(shè)置一個不含模板DNA但含PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對照反應。這一對照管須在準備好所有其他PCR以后才進行吸加）。⑥實驗室污染

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.賃盤磷謀廈篇巖奶岸軍賞景隧關(guān)閃后乳腳眨術(shù)扮怯蠕翌戲陵甘邀荒烏僅派臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af55ppt課件⑤不明原因引起公用試劑如液體石蠟等污染Evaluation3.PCR檢測結(jié)果不穩(wěn)定（1）樣品處理方法不當，標本中雜質(zhì)很多，血清標本有蛋白質(zhì)、血紅素、代謝產(chǎn)物等。蛋白質(zhì)——DNA電泳帶拖尾血紅素中的卟啉化合物——抑制Taq酶活性代謝產(chǎn)物——干擾引物配對

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.鵲浸孫弟霄蔥百駝至奇腫異燼磊腐空賬帽漓增梨溉翻當?shù)誀q禍柵揭殊烈淋臨床基因擴增檢驗操作規(guī)范JfMlWaF5H7jL2m80Af56ppt課件3.PCR檢測結(jié)果不穩(wěn)定Evaluationonly.（2）操作不當帶來的后果

主要指不能嚴格按照說明進行操作造成PCR檢測失敗。如HCVRNAPCR