基因表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)課件

酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)1屬于真核生物,可進(jìn)行翻譯后修飾,如糖基化2操作容易3經(jīng)濟(jì)4快速1酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)1酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)2酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)2兩種酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)Saccharomycescerevisiae過去常用畢赤酵母

Pichiapastoris現(xiàn)在多用3兩種酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母3Pichiapastoris表達(dá)系統(tǒng)

Pichiapastoris是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作為唯一的碳源.易操作,培養(yǎng)容易表達(dá)量高,可達(dá)培養(yǎng)液中10g/L可以有真核生物的翻譯后修飾,如糖基化避免了釀酒酵母的過糖基化問題4Pichiapastoris表達(dá)系統(tǒng)Pichiapa551.Pichiapastoris的表達(dá)載體胞內(nèi)表達(dá)載體胞外表達(dá)載體P.pastoris沒有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒，所以一般用整合型載體作為外源基因的表達(dá)載體

61.Pichiapastoris的表達(dá)載體胞內(nèi)表達(dá)載體Alcoholoxidase,醇氧化酶,將甲醇氧化成甲醛通過高表達(dá)來補(bǔ)償酶活性不足,因此有強(qiáng)啟動(dòng)子AOX1是主要的酶受甲醇嚴(yán)格控制啟動(dòng)子用來驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)AOX2利用甲醇的能力低生長(zhǎng)慢7Alcoholoxidase,醇氧化酶,將甲醇氧化成甲宿主His4突變，不能合成組氨酸，在His缺陷培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)；質(zhì)粒上有His4,可合成組氨酸，用His缺陷平板篩選轉(zhuǎn)化菌株。histidinoldehydrogenasegene(his4)8宿主His4突變，不能合成組氨酸，在His缺陷培養(yǎng)基上不能2.CONSTRUCTIONOFTHEVECTOR92.CONSTRUCTIONOFTHEVECTOR胞內(nèi)表達(dá)載體,pAO815

10胞內(nèi)表達(dá)載體,pAO81510胞外表達(dá)載體,pIC9K11胞外表達(dá)載體,pIC9K11pPIC9k,胞外表達(dá)載體12pPIC9k,胞外表達(dá)載體123.多拷貝產(chǎn)生，pIC9K,體內(nèi)形成多拷貝因?yàn)槲淳€性化的環(huán)狀質(zhì)粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低未線性化的環(huán)狀質(zhì)粒發(fā)生同源重組的幾率非常低133.多拷貝產(chǎn)生，pIC9K,體內(nèi)形成多拷貝因?yàn)槲淳€性化的pAO815

可體外構(gòu)建多拷貝14pAO815

可體外構(gòu)建BamHI：GGATCCCCTAGGBglII：AGATCTTCTAGA15BamHI：GGATCCBglII：AGATCT154.

宿主細(xì)胞PichiaStrain基因型GS115AOX1正常，Mul+KM71AOX1被破壞，MulS宿主的histidinoldehydrogenasegene(his4)突變可以在完全培養(yǎng)基YPD和含組氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)在表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入后才能在組氨酸缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)本身的回復(fù)突變?yōu)?/108。164.宿主細(xì)胞PichiaStrain基因型GS115轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的甲醇利用能力GS115KM71AOX1正常，Mul+AOX1被破壞，MulS轉(zhuǎn)化后對(duì)甲醇的利用KM71無論在那里交換，只能是甲醇低利用，因?yàn)樗拗鳑]有AOX1甲醇高利用SalI、StuI切甲醇低利用BglII切GS115取決于質(zhì)粒在宿主細(xì)胞基因組上交換的位置是否破壞宿主的AOX117轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的甲醇利用能力GS115KM71AOX1正常，線性化位點(diǎn)質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞線性化質(zhì)粒發(fā)生同源重組的幾率提高18線性化位點(diǎn)質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞線性化質(zhì)粒發(fā)生同源重組的pAO815和pPIC9K在SalI、StuI單切,

在his4插入（單交換），不破壞宿主的AOX1，轉(zhuǎn)化GS115后產(chǎn)生：His+/Mut+單交換同源重組基因轉(zhuǎn)移法：是將外源基因定位導(dǎo)人受體細(xì)胞染色體上的方法，因?yàn)樵谠撟挥信c導(dǎo)人基因同源的序列，通過單一或雙交換，新基因片段可替換原有基因片段。19pAO815和pPIC9K單交換同源重組基因轉(zhuǎn)移法：是將外pAO815和pPIC9K在BglII雙切：在5AOX1位點(diǎn)和3AOX1雙交換，替換掉了宿主的AOX1基因，轉(zhuǎn)化后GS115產(chǎn)生His+/Muts

BglIIHis45AOX13AOX1geneHis4AOX120pAO815和pPIC9K在BglII雙切：BglII2121技術(shù)路線選擇合適的內(nèi)切酶位點(diǎn)將基因插入載體注:pAO815和pIC9K是穿梭載體,可在大腸桿菌中操作pAO815體外構(gòu)建多拷貝轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞線性化質(zhì)粒組氨酸缺陷平板篩選重組子22技術(shù)路線選擇合適的內(nèi)切酶位點(diǎn)注:pAO815pAO815轉(zhuǎn)化G418篩選pIC9K多拷貝

PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的基因插入誘導(dǎo)表達(dá)SDS檢測(cè)pAO815和pPIC9K23G418PCR檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)pAO815和pPIC9K23酵母菌轉(zhuǎn)化PEG1000TransformationMethodforPichiaBufferA:1.0MSorbitol(山梨醇),10mMBicine（N-二羥乙基甘氨酸）,pH8.35(Sigma),3%(v/v)ethyleneglycol(乙二醇

)BufferB:40%(w/v)Polyethyleneglycol1000(Sigma),0.2MBicine,pH8.35BufferC:0.15MNaCl,10mMBicine,pH8.35Filtersterilizeandstoreat-20°C.24酵母菌轉(zhuǎn)化PEG1000TransformationM制備感受態(tài)細(xì)胞1.劃線接種酵母菌，YPD平板，30°Cfortwodays.2.挑菌落于10mlYPD30°C搖過夜.3.轉(zhuǎn)培養(yǎng)到100mlYPD，startingOD600of0.1andgrowat30°CtoanOD600of0.5to0.8.4.3000xg收集細(xì)胞，用50mlofBufferA洗細(xì)胞，室溫.5.細(xì)胞懸浮在4mlofBufferA中，分裝成0.2ml于滅菌的管中，每管加11μlDMSO（-70度），混勻，液氮快速冷凍，-70°C保存。25制備感受態(tài)細(xì)胞1.劃線接種酵母菌，YPD平板，30°C保持感受態(tài)細(xì)胞在冰凍狀態(tài)作轉(zhuǎn)化！Cellcompetencedecreasesveryrapidlyafterthecellsthawevenwhenheldonice.

ItiscriticaltoaddDNAtofrozencellsamples.

Toperformmultipletransformations,itisrecommendedtoprocessthemingroupsofsixatatime.26保持感受態(tài)細(xì)胞在冰凍狀態(tài)作轉(zhuǎn)化！CellcompetencTransformation1.10-50μgDNA（20μl液體中），直接加到still-frozentubeofcompetentcells（40μgofdenaturedandsonicatedsalmonspermDNA）；2.37°C水浴5分鐘，中間混勻兩次；3.加1.5mlofBufferB，徹底混勻；4.30°C水浴1hour；5.2000xg離心10，RT，去上清，細(xì)胞懸浮在1.5mlBufferC中；6.離心后將細(xì)胞懸浮在0.2mlBufferC中；7.將細(xì)胞涂布在選擇培養(yǎng)平板（MD）上，30°Cfor3to4days.27Transformation1.10-50μgDNA儲(chǔ)存液10XYNB(13.4%YeastNitrogenBasewithAmmoniumSulfatewithoutaminoacids)，抽濾；500XB(0.02%Biotin)，抽濾；10XD(20%Dextrose葡萄糖)，抽濾；10XM(5%Methanol)，抽濾；10XGY(10%Glycerol)，高壓；1Mpotassiumphosphatebuffer,pH6.0，高壓。28儲(chǔ)存液10XYNB(13.4%YeastNitrogYPD培養(yǎng)基YeastExtractPeptoneDextroseMedium(1liter)1%yeastextract2%peptone900mlofwaterAutoclavefor20minutesonliquidcycle.2%dextrose(glucose)，（20%儲(chǔ)存液，抽濾滅菌）。Note:Add20gofagarifmakingYPDplates。29YPD培養(yǎng)基YeastExtractPeptoneDeMinimalDextrose

MD平板成分：1.34%YNB（yeastnitrogenbase，酵母培養(yǎng)基）4x10-5%biotin2%dextrose配制方法：1.800ml水，（平板加15gagar），滅菌20；2.冷卻到60°C，加100mlof10XYNB，2mlof500Xbiotin，100mlof10Xdextrose；3.倒平板。30MinimalDextrose

MD平板成分：1.34%

BMGY：BufferedGlycerol-complexMedium

BMMY：BufferedMethanol-complexMedium(1liter)

成分：1%yeastextract2%peptone100mMpotassiumphosphate,pH6.01.34%YNB4x10-5%biotin

1%glycerol（BMGY）or0.5%methanol（BMMY）31

BMGY：BufferedGlycerol-comp323233333434畢赤酵母具有高等真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)：1.蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等。2.操作時(shí)與E.coli及釀酒酵母同樣簡(jiǎn)單。它比桿狀病毒或哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)等其它真核表達(dá)系統(tǒng)更快捷、簡(jiǎn)單、廉價(jià)，且表達(dá)水平更高。3.同為酵母，畢赤酵母具有與釀酒酵母相似的分子及遺傳操作優(yōu)點(diǎn)，且它的外源蛋白表達(dá)水平是后者的十倍以至百倍。

這些使得畢赤酵母成為非常有用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

35畢赤酵母具有高等真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)：35畢赤酵母系統(tǒng)的注意事項(xiàng)嚴(yán)格無菌操作，防止污染；可以鏡檢溫度≤30C;轉(zhuǎn)化PCR檢測(cè)5.誘導(dǎo)時(shí)間36畢赤酵母系統(tǒng)的注意事項(xiàng)嚴(yán)格無菌操作，防止污染；可以鏡檢36酵母蛋白糖基化釀酒酵母與畢赤酵母大多數(shù)為N-連接糖基化高甘露糖型；然而畢赤酵母中蛋白翻譯后所增加的寡糖鏈長(zhǎng)度（平均每個(gè)支鏈8-14個(gè)甘露糖殘基）比釀酒酵母中的（50-150個(gè)甘露糖殘基）短得多，但比人的大；釀酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖連接頭，而畢赤酵母則沒有。一般認(rèn)為α-1,3聚糖接頭與蛋白的超抗原性有關(guān)，使得這些蛋白不適于治療應(yīng)用。37酵母蛋白糖基化釀酒酵母與畢赤酵母大多數(shù)為N-連接糖基化高甘露蛋白質(zhì)糖基化蛋白質(zhì)的糖基化是真核生物的一種常見的翻譯后修飾方式；糖基化影響蛋白折疊、定位、轉(zhuǎn)運(yùn)、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期。38蛋白質(zhì)糖基化蛋白質(zhì)的