RT-PCR詳細(xì)圖文精選解析

.一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理（一）定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR謝謝閱讀進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。精品文檔放心下載（二）實(shí)時(shí)原理1、常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)精品文檔放心下載增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。2、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過感謝閱讀Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析3、如何對(duì)起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析.4、幾個(gè)概念：（1）擴(kuò)增曲線：.（2）熒光閾值：（3）Ct值：.CT值的重現(xiàn)性：5、定量原理：.理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：X=X0(1+Ex)n感謝閱讀n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率5、標(biāo)準(zhǔn)曲線6、絕對(duì)定量1）確定未知樣品的C(t)值2）通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量精品文檔放心下載.7、DNA的熒光標(biāo)記：二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹方法一：SYBRGreen法.（一）工作原理1、SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位感謝閱讀2、SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光謝謝閱讀3、變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光4、復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。謝謝閱讀..PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:1、SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱，不易檢測(cè)感謝閱讀2、Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)感謝閱讀3、MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物感謝閱讀4、反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化5、反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定6、其他與常規(guī)PCR相同（二）應(yīng)用范圍1、起始模板的測(cè)定；2、基因型的分析；.3、融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對(duì)常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對(duì)primer謝謝閱讀的評(píng)價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。精品文檔放心下載（三）優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)DNA模板沒有選擇性；適用于任何DNA；使用方便；不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針；感謝閱讀非常靈敏；便宜。缺點(diǎn)：容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性；但可以通過融解曲線的分析，感謝閱讀優(yōu)化反應(yīng)條件； 對(duì)引物特異性要求較高。方法二：TaqMan---水解型雜交探針**5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等謝謝閱讀**3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)謝謝閱讀探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光**Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針謝謝閱讀（一）工作原理.注意：每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光感謝閱讀PCR反應(yīng)的建立：1、引物、探針的設(shè)計(jì)：探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素，謝謝閱讀引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400bp，引物Tm為59-60℃精品文檔放心下載2、反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）精品文檔放心下載也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72℃，45S，.3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，信號(hào)/背景比值的最大值感謝閱讀引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同（二）優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)目