免疫學(xué)技術(shù)-化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)（臨床免疫檢驗課件）

電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析是目前非常先進的標(biāo)記免疫測定技術(shù)，是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫測定以后的新一代標(biāo)記免疫測定技術(shù)，具有靈敏、快速和穩(wěn)定的特點，在固相標(biāo)記免疫測定中技術(shù)上居領(lǐng)先地位前言電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，通過抗原抗體反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的抗原或抗體進行定量分析，包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+是電化學(xué)發(fā)光劑，以修飾后的三聯(lián)吡啶釕直接標(biāo)記抗原或抗體，以三丙胺作為電子供體，在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+發(fā)光原理檢測原理檢測原理關(guān)鍵技術(shù)將待偶聯(lián)的抗體以適當(dāng)濃度溶解于碳酸氫鈉溶液中；用二甲基甲酰胺(DMF)溶解生物素。按一定摩爾濃度比將兩者混合，室溫下攪拌之后透析除去游離生物素生物素標(biāo)記抗體的制備鏈霉親和素可以吸附在納米磁性微球表面上。一些納米磁性微球表面帶有某些功能基團，可通過化學(xué)鍵與鏈霉親和素分子連接鏈霉親和素與納米磁性微球的偶聯(lián)方法評價123標(biāo)記物性質(zhì)穩(wěn)定抗干擾能力強具有靈敏度高、線性范圍寬、反應(yīng)時間短、試劑穩(wěn)定性好等特點三丙胺溶液可重復(fù)使用，在電極表面氧化還原反應(yīng)周而復(fù)始進行，光信號更強、持續(xù)時間更長，易于測定臨床應(yīng)用激素貧血因子腫瘤標(biāo)記物病原體血清標(biāo)志物甲狀腺激素生殖激素腎上腺激素垂體激素維生素B12葉酸紅細胞葉酸鐵蛋白AFPCEAPSACA19-9HBsAgHBsAbHBeAgHBeAb胰島素C-肽肌紅蛋白肌鈣蛋白骨膠原酶脫氧吡啶啉總lgE特異性lgE茶堿地高辛環(huán)孢素巴比妥治療藥物監(jiān)測過敏性疾病骨代謝糖尿病和心血管疾病01020304電化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法類型電化學(xué)發(fā)光免疫分析的關(guān)鍵技術(shù)電化學(xué)發(fā)光免疫分析的臨床應(yīng)用

小結(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫分析的檢測原理思考題1.電化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理是什么？方法類型有哪些？2.常用的電化學(xué)發(fā)光劑是什么？發(fā)光氧通道免疫分析發(fā)光氧通道免疫分析采用均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)路線，具有均相、免洗、光激發(fā)等技術(shù)特點，不需要多次洗滌、分離，屬于均相反應(yīng)模式前言發(fā)光氧通道免疫分析發(fā)光氧通道免疫分析（LOCI）是以納米微粒為基礎(chǔ)的均相化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)發(fā)光氧通道免疫分析反應(yīng)體系覆蓋有親和素和酞菁染料的乳膠聚苯乙烯微球，可以吸收680nm的光，生成高能單線態(tài)氧感光微球（納米級）反應(yīng)體系發(fā)光微球含有烯烴染料和特異性抗體（抗原），可以與單線態(tài)氧反應(yīng)，發(fā)出612nm光信號，被LOCI檢測器讀取發(fā)光微球（納米級）反應(yīng)體系可以與含有親和素的感光微球結(jié)合感光微球發(fā)光微球生物素化抗體（抗原）檢測原理方法類型雙抗體夾心法雙抗原競爭法無需分離結(jié)合物與游離物，為均相化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)分離方法技術(shù)要點采用長臂活化生物素優(yōu)化反應(yīng)體積、最適反應(yīng)條件等選擇一對相互匹配的抗體分別用于包被發(fā)光微球和標(biāo)記生物素經(jīng)孵育反應(yīng)使發(fā)光微球和感光微球的距離小于200nm納米微球攜帶功能基團可直接與蛋白質(zhì)（抗體）偶聯(lián)測定產(chǎn)生的熒光信號以雙抗體夾心法為例抗體匹配發(fā)光微球與抗體偶聯(lián)生物素標(biāo)記抗體優(yōu)化檢測體系抗原抗體反應(yīng)檢測臨床應(yīng)用心肌標(biāo)志物生殖內(nèi)分泌激素甲狀腺激素腫瘤標(biāo)志物傳染病炎癥01020304050601020304發(fā)光氧通道免疫分析的方法類型發(fā)光氧通道免疫分析的關(guān)鍵技術(shù)發(fā)光氧通道免疫分析的臨床應(yīng)用

小結(jié)發(fā)光氧通道免疫分析的檢測原理思考題1.發(fā)光氧通道免疫分析的原理是什么？方法類型有哪些？2.目前該技術(shù)的臨床應(yīng)用有哪些？酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析在我國免疫體外診斷行業(yè)中，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)憑借其高靈敏度、高特異性，檢測時間短，可定量檢測，可實現(xiàn)自動化的特點，成為主流技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷和科研。我國化學(xué)發(fā)光行業(yè)發(fā)展起步較晚，從國內(nèi)化學(xué)發(fā)光企業(yè)的整體技術(shù)水平來看，大部分國產(chǎn)體外診斷產(chǎn)品依然采用酶促發(fā)光技術(shù)前言酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶標(biāo)記抗原或抗體，發(fā)光底物在酶的催化下發(fā)光，通過測定發(fā)光強度以實現(xiàn)對待測物質(zhì)的免疫分析，也稱之為發(fā)光酶免疫分析(LEIA)酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析酶促反應(yīng)發(fā)光劑利用標(biāo)記酶的催化作用使底物發(fā)光這一類需酶催化后發(fā)光的物質(zhì)稱為酶促反應(yīng)發(fā)光劑酶促發(fā)光免疫分析根據(jù)發(fā)光底物性質(zhì)分類化學(xué)發(fā)光酶免疫分析熒光酶免疫分析采用熒光底物測定熒光強度采用發(fā)光底物測定光強度發(fā)光底物發(fā)光底物1.魯米諾及其衍生物：是HRP最常用的發(fā)光底物2.對-羥基苯乙酸：是HRP的熒光底物熒光底物1.AMPPD：是ALP常用的發(fā)光底物2.4-甲基傘形酮磷酸鹽：是ALP的熒光底物辣根過氧化物酶(HRP)的發(fā)光底物堿性磷酸酶(ALP)的發(fā)光底物檢測原理酶促發(fā)光免疫分析屬于非均相免疫分析系統(tǒng)測定前，需采用固相吸附分離方法將結(jié)合標(biāo)記物(B)和游離標(biāo)記物(F)分離根據(jù)固相載體的不同酶促化學(xué)發(fā)光又分為板式化學(xué)發(fā)光和微粒子化學(xué)發(fā)光板式化學(xué)發(fā)光板式化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測原理微粒子化學(xué)發(fā)光發(fā)光酶免疫分析檢測原理微粒子化學(xué)發(fā)光熒光酶免疫分析檢測原理分離技術(shù)1用抗原或抗體包被磁顆粒，通過一定反應(yīng)模式在磁場將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)酶標(biāo)記物進行分離磁顆粒分離法包被載體為無磁性微粒子，用纖維膜柱子進行酶標(biāo)記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離微粒子捕獲法23在聚苯乙烯反應(yīng)珠或反應(yīng)孔上包被已知抗體，通過洗滌將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標(biāo)記物進行分離包被聚苯乙烯珠或孔分離法方法評價01040203采用納米微球作為固相載體，比表面積大，結(jié)合抗體的容量大，從而拓寬了分析的線性范圍酶催化發(fā)光底物發(fā)出的光穩(wěn)定，持續(xù)時間長，與色源底物相比，具有更高的分析敏感度自動化水平較高酶促發(fā)光免疫分析采用酶蛋白作為標(biāo)記物其活性易受環(huán)境因素影響臨床應(yīng)用激素貧血因子腫瘤標(biāo)記物病原體血清標(biāo)志物甲狀腺激素生殖激素腎上腺激素垂體激素維生素B12葉酸紅細胞葉酸鐵蛋白AFPCEAPSACA19-9HBsAgHBsAbHBeAgHBeAb胰島素C-肽肌紅蛋白肌鈣蛋白骨膠原酶脫氧吡啶啉總lgE特異性lgE茶堿地高辛環(huán)孢素巴比妥治療藥物監(jiān)測過敏性疾病骨代謝糖尿病和心血管疾病01020304酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析的方法類型酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析的關(guān)鍵技術(shù)酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析的臨床應(yīng)用

小結(jié)酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析的檢測原理思考題1.酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理是什么？方法類型有哪些？2.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物有哪些？直接化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析是目前世界公認的先進體外免疫診斷技術(shù)，我國大多數(shù)三甲醫(yī)院化學(xué)發(fā)光免疫分析已成為免疫診斷的主流，直接化學(xué)發(fā)光免疫分析是目前主流的化學(xué)發(fā)光技術(shù)之一前言簡稱化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）是用化學(xué)發(fā)光劑吖啶酯（AE）標(biāo)記抗原或抗體，以納米微球作為固相載體，在堿性校正液作用下結(jié)合標(biāo)記物發(fā)光，通過測定發(fā)光強度以實現(xiàn)對超微量物質(zhì)的定量分析方法化學(xué)發(fā)光免疫分析直接化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光免疫分析使用的發(fā)光劑是吖啶酯方法類型夾心法間接法競爭法123檢測原理發(fā)光標(biāo)記物的制備吖啶酯標(biāo)記抗原或抗體前需進行修飾吖啶酯活化吖啶酯固相載體化學(xué)發(fā)光免疫分析通常采用600~800nm的順磁性顆粒作為固相載體，在電磁場中，通過洗滌分離出結(jié)合狀態(tài)的標(biāo)記物方法評價0102吖啶酯具有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)簡單、快速，發(fā)光本底較低，無需催化劑等優(yōu)點0304活化吖啶酯可直接標(biāo)記抗原或抗體，結(jié)合物穩(wěn)定，不影響吖啶酯發(fā)光效率及抗原或抗體免疫活性固相載體采用納米磁性微球可增大包被面積，加快反應(yīng)“分離-洗滌”簡便、快捷吖啶酯發(fā)光為瞬間發(fā)光，持續(xù)時間短，對信號檢測儀的靈敏度要求較高臨床應(yīng)用激素貧血因子腫瘤標(biāo)記物病原體血清標(biāo)志物甲狀腺激素生殖激素腎上腺激素垂體激素維生素B12葉酸紅細胞葉酸鐵蛋白AFPCEAPSACA19-9HBsAgHBsAbHBeAgHBeAb胰島素C-肽肌紅蛋白肌鈣蛋白骨膠原酶