腫瘤體外藥敏檢測

腫瘤體外藥敏檢測第1頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月☆腫瘤化療藥物敏感性試驗

是個體化治療的基礎

腫瘤化療藥物敏感性試驗(TCA)

TumorChemosensitivityAssay

將腫瘤細胞進行體外的有藥培養(yǎng)，然后通過檢測細胞活性的有關指標，判斷不同藥物的療效。通過這種試驗，即可確定針對個體腫瘤細胞具有最佳療效的化療藥物或藥物組合。

第2頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月1.腫瘤細胞的異質(zhì)性(heterogeneity)腫瘤的發(fā)生具有多階段、多基因的特點，而同一種腫瘤的基因特性和發(fā)生階段都可能會有非常大的差別；表現(xiàn)出在形態(tài)上和生物學功能上的極大的不同。這種腫瘤細胞的異質(zhì)性已經(jīng)得到越來越清楚的認識。 腫瘤細胞的異質(zhì)性主要表現(xiàn)在

形態(tài)異質(zhì)性：病理學上的形態(tài)多種多樣。

基因異質(zhì)性：腫瘤的發(fā)生經(jīng)歷了多基因的改變，同一種基因可以有多個突變位點。如P53基因的突變位點就已發(fā)現(xiàn)有2000個之多。

功能異質(zhì)性：基因的異質(zhì)性導致生物學功能的異質(zhì)性。第3頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月左：腸型腺癌(胃)右：彌漫型胃癌第4頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月2.臨床與個體化治療化療作為全身性治療的手段，在惡性腫瘤的治療中具有不可替代的地位。同種腫瘤對化療藥物具有不同的反應性，忽視個體差異僅憑經(jīng)驗式化療存在盲目性，使得總體療效不佳。尤其對實體瘤，經(jīng)驗化療的療效僅為20％左右。臨床需要切實可行的檢測方法，在用藥前篩選出敏感藥物，以進行針對性較強的個體化治療；是否進行個體化治療成為腫瘤化療能否成功的關鍵因素。第5頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月050100150200250020406080100ATP-TCA指導的化療(n=39)傳統(tǒng)化療(n=17)p=0,0009Weeks%Patients050100150200250020406080100ATP-TCA指導的化療(n=39)傳統(tǒng)化療(n=17)p=0,0016Weeks%PatientsOverallSurvivalProgressionfreeSurvival引自KurbacherCM,CreeIA,Brucker.AnticancerDrugs.1998,9:51-57

傳統(tǒng)化療和ATP-TCA指導的化療的生存率比較第6頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月☆腫瘤化療藥敏方法發(fā)展及簡介

化學治療是腫瘤的三大治療手段之一。近30年來，雖然某些惡性腫瘤的化學治療有明顯改善，但多數(shù)腫瘤，特別是實體瘤療效仍不理想。這與腫瘤存在個體差異性，以及多重耐藥性（MDR）等因素有關。因此如何選擇有效藥物，進行有的放矢的治療早已成為化療界所關注的問題。早在上世紀60年代已有報告，用卵巢癌組織進行藥敏檢測，該組病人中位生存期有明顯延長?；熕幟魴z測已發(fā)展成為體外（invitro）與體內(nèi)（invivo）兩類，成為“當今癌癥研究的主攻課題”之一。第7頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月理想的藥敏檢測方法應該具備的條件操作簡便，可以標準化，便于推廣標本可評價率高檢測敏感、可靠、客觀臨床相關性腫瘤化療藥敏方法發(fā)展創(chuàng)新方向1.標準化，精確定量（無論是用藥量或細胞數(shù)等）2.對體內(nèi)環(huán)境的極近模擬一、體外藥敏檢測第8頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）瘤細胞直接損害試驗新鮮腫瘤標本制成單細胞懸液，與抗癌藥接觸1～數(shù)小時后，洗去抗癌藥，加入染色劑，與未加藥對照樣本比較，可從瘤細胞的殺傷比例判斷藥物抗腫瘤效應。根據(jù)染色劑與觀察指標的不同，可分為：美蘭法、伊紅臺盼藍法、吖啶橙熒光測定法、同位素釋放法等。上述試驗周期短、成本低、方法簡便，但準確性差，現(xiàn)已少用或僅作為細胞存活與否的判斷方法。第9頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）原代瘤細胞培養(yǎng)體外藥敏預測一般采用短期原代培養(yǎng)。在無菌條件下，用機械法和／或酶消化法，將新鮮腫瘤標本分離為組織塊、細胞團或分散的單個細胞（視瘤組織多寡及所用培養(yǎng)方法而定），與各種抗癌藥分別作用一定時間后，與對照組比較，可計算用藥組的瘤細胞殺傷比例，測出抗癌藥物敏感度。第10頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月主要的原代瘤細胞培養(yǎng)藥敏檢測方法及其存在的問題藥敏檢測方法存在問題集落形成法（HTCA）

標本可評價率低，僅有40~70％。實驗周期長，需要2周以上測試藥物種類和數(shù)量有限操作繁瑣，難以標準化陽性預測值較低，僅有40～60％四唑藍比色法(MTT)

敏感性較差，最低僅能檢測500個細胞

量程較小，有效量程在2.0以內(nèi)細胞毒性差異染色法(DiSC)

可適用標本類型不廣，目前僅用于血液腫瘤人為判斷因素較大，難以推廣標本可評價率不高，僅有70～80％陽性預測值較低，僅有70～80％胸腺嘧啶核苷摻入法(3H-TdR)

實驗人員接觸放射，不利于健康標本可評價率不高，僅有70～80％

測試結(jié)果僅能反映少量處于增殖相的腫瘤細胞對某些藥物的測試結(jié)果存在假陰性第11頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月原代瘤細胞培養(yǎng)藥敏檢測方法的幾點提示本類方法在與其他學科的結(jié)合中仍在不斷探索發(fā)展，并無完美及完全定形的技術，各方法內(nèi)部尚有細化及改進方法。腫瘤細胞貼壁法、瘤細胞粘附培養(yǎng)法、細胞團培養(yǎng)法及流式細胞儀測定法等已成為細胞分子生物學技術手段，不再作為獨立的藥敏檢測方法。一些相對簡便經(jīng)濟的方法在目前仍應積極提倡，如MTT比色法。第12頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）同步瘤細胞培養(yǎng)將處于不同細胞周期的瘤細胞分離培養(yǎng)，可研究藥物的周期特異性作用。1.藥物阻斷法如長春新堿使細胞阻滯于M期，博萊霉素則使其堆積于G2期。2.物理法運用細胞同步化技術，如M期細胞震蕩收集法，可避免藥物阻斷法的干擾作用。第13頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）瘤細胞連續(xù)培養(yǎng)瘤細胞培養(yǎng)一定時間后（通常為1～4周），細胞生長增殖達到一定密度，產(chǎn)生密度抑制。故需分離出一部分細胞，進行傳代培養(yǎng)，并可建立細胞株。本法得到的瘤細胞數(shù)量多，在抗癌新藥篩選中起重要作用。缺點是實驗周期長，只能作回顧性藥敏檢測。第14頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月二、體內(nèi)藥敏檢測即異種移植法。通常用嚙齒類動物做移植宿主。將人癌標本移植于受試動物體內(nèi)如腎包膜下移植法（SRCA）

，再給予抗癌藥。數(shù)天至數(shù)周后處死動物，測量移植瘤的大小變化，以評定藥物敏感度。本法較體外試驗更接近人體情況，對需要體內(nèi)代謝而發(fā)揮作用的藥物，如臨床常用的環(huán)磷酰胺尤為適宜。還可測試聯(lián)合化療方案的療效，臨床意義較大。體外試驗與體內(nèi)試驗可交替應用。如將體外培養(yǎng)的瘤細胞植入裸鼠體內(nèi)，或?qū)⑷税┮浦擦鲈僮鱄CTA培養(yǎng)均可。第15頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月☆幾種原代瘤細胞培養(yǎng)藥敏檢測方法簡介

一、MTT比色法

四氮唑化合物MTT（Methylthiazolyltetrazolium）在活細胞線粒體酶作用下可裂解為紫藍色不溶性的甲臜化合物（Formazan），加入異丙醇或二甲基亞砜后，用分光光度計（酶標儀）測出其光密度變化。本法簡單迅速，操作可半自動化。缺點是不能區(qū)分正常細胞與腫瘤細胞，此外對于不同類型的腫瘤標本可能需要不同的細胞濃度與藥物作用時間。故有待進一步改進。目前已有藥物梯度濃度的引入。第16頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

二、ATP-TCAATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測

技術原理：在有氧條件下,熒光酶（luciferase）可以催化熒光素（luciferin）釋放出熒光（波長為562nm），同時ATP轉(zhuǎn)變成AMP。所釋放的熒光強度與胞內(nèi)ATP含量呈正相關。細胞死亡后，胞內(nèi)ATP迅速水解，而活細胞的ATP含量基本恒定。因此所測得的熒光強度反映了活細胞的數(shù)量。比較藥物系列濃度對培養(yǎng)細胞的不同抑制率，參照相應判斷指標，從而可以評估該化療藥物對腫瘤細胞的殺傷效果。

ATP+Luciferin+O2

AMP+2Pi+Photons+OxylaluciferinLuciferase第17頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光強度與活細胞數(shù)量的關系第18頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月技術流程TumorSingleCellsuspensionMechanicalandenzymaticaldissociationIncubationfor3-5daysAdditionofdrugs/mediumATP-LuminescenceATPextractionandstabilizationSoftwareEvaluationConstructionofdose-responseplots第19頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月國內(nèi)外研究歷史回顧1.1982年，Moyer等首先提出內(nèi)源性ATP的含量可以反映細胞活性;隨后Kangas等相繼證實生物熒光技術是一種敏感、可靠的確定各種細胞活性的檢測方法。2.自1988年，Sevin首先將此方法用于新鮮腫瘤組織的藥敏檢測，在歐洲和美國已經(jīng)進行了大量的臨床應用研究。3.1998年，Kurbacher等人報道了ATP-TCA輔助化療與傳統(tǒng)化療比較的臨床Ⅱ期試驗結(jié)果，試驗結(jié)果表明，ATP-TCA指導的化療治療復發(fā)性卵巢癌較傳統(tǒng)化療模式更能提高臨床療效，延長病人總生存期和無進展生存期。4.NIH的GOG(GynecologicOncologyGroup)項目組認為ATP-TCA是最有發(fā)展前途的一種藥敏試驗方法，已納入重點科研項目(1998)。第20頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月目前先進國家對該技術的評價1998年德國DCS公司將該技術產(chǎn)業(yè)化，并獲得國際ISO質(zhì)量評估體系認證，在歐洲和北美市場獲得準入。2.2001年，美國全國醫(yī)療保險協(xié)會(HealthMaintenanceOrganization)認為，該技術是一項精確和可靠的并能指導醫(yī)生選擇用藥的先進技術，建議在全美進行醫(yī)療保險賠付。目前在加州等15個州已獲醫(yī)療保險賠付。3.2003年日本厚生省和保險聯(lián)合會也認為，該技術是一項先進的臨床醫(yī)學項目，該技術指導的腫瘤化療較傳統(tǒng)的化療方案更能明顯提高胃腸道腫瘤的治愈率，建議該項技術在全國范圍內(nèi)獲得醫(yī)療保險賠付。

ATP-TCA技術是目前最先進的體外藥敏技術，該技術敏感可靠，具有極大的臨床應用價值第21頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月主要試劑儀器

ATP-TCA核心試劑盒（德國DCS）：包括完全分析培養(yǎng)基（CAM）、最大ATP抑制劑、組織消化酶液、ATP提取液、熒光素-熒光素酶（lulu）、ATP標準品、無菌96微孔培養(yǎng)板。自發(fā)光分析儀（德國Berthold）、超凈工作臺

ATP-TCA技術的核心試劑◎.熒光酶試劑(luciferin-luciferasecountingreagent)

熱穩(wěn)定性和發(fā)光效率均好的重組酶試劑保證檢測的敏感性和可靠性，滿足臨床實際工作的需要◎.

培養(yǎng)基(completeassaymedium)

腫瘤細胞選擇性培養(yǎng)基支持腫瘤細胞生長增殖，促進正常細胞死亡，從而保證藥敏檢測的腫瘤細胞特異性

第22頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)前后細胞組成變化

培養(yǎng)前細胞組成3-5天培養(yǎng)后細胞組成淋巴上皮成纖維腫瘤淋巴上皮成纖維腫瘤細胞細胞細胞細胞

細胞細胞細胞細胞40-50%10-25%5-10%10-20%<1%<10%<10%>80%選擇性培養(yǎng)基的研究結(jié)果表明該培養(yǎng)基具有良好的選擇性，適合腫瘤體外藥敏檢測的需要第23頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月ATP-TCA

藥物測試方式第24頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗過程

實體瘤（也可以是穿刺樣品或腹水等液體樣品）先被切碎，并用酶分離成細胞懸液。這一過程并不影響腫瘤細胞的活性。將細胞懸液加入到含有濃度不同的化療藥物的無血清培養(yǎng)基（CAM）中，在培養(yǎng)基板中培養(yǎng)3-5天。CAM培養(yǎng)基可以抑制非瘤細胞的生長，選擇性培養(yǎng)腫瘤細胞。培養(yǎng)后，加入可以穩(wěn)定細胞內(nèi)ATP的提取試劑，提取出ATP。加入熒光素-熒光素酶系統(tǒng)，在板式發(fā)光分析儀上進行ATP的檢測。根據(jù)含藥孔的熒光值與無藥孔（M0）的熒光值的比較，得出該濃度化療藥物對腫瘤細胞的抑制值。做出化療藥物的劑量-抑制曲線，得到AUC值、IC90、IC50以及敏感度指數(shù)SI值，判斷化療藥物的敏感度。

第25頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月劑量-抑制曲線第26頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月評價標準強敏感(SS)：IC50<25%及IC90<100%PPC中度敏感(IS)：IC50<25%及IC90>100%PPC輕度敏感(MS)：IC50>25%及IC90<100%PPC耐藥(R)：IC50>25%及IC90>100%PPC化療藥物敏感性分析：下列指標可以說明藥物的敏感性和耐藥性高AUC，低IC50,IC90,SI值，和高TGI值，顯示100％腫瘤細胞生長抑制，藥物的敏感性就高。低AUC，高IC50,IC90,SI值，和低TGI值，表示對藥物的高耐藥性。第27頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月三、組織培養(yǎng)藥物敏感性檢測技術HistocultureDrugResponseAssay(HDRA)HDRA技術由Hoffman等人于80年代末期建立,是一種基于非分散性組織的藥物敏感性檢測技術,該技術將微小組織培養(yǎng)于一種天然膠原海綿基質(zhì)上,同時加入抗癌藥物對其作用一定的時間,細胞活性終點評價采用MTT還原法,結(jié)果較為直觀可靠。第28頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月HDRA技術流程1.腫瘤組織預處理:去脂肪,纖維以及血污.2.腫瘤組織處理:清洗,眼科鑷子和小剪刀進行剪切,使組織塊大小約為1-2mm.3.將3塊組織塊放置于約1cm2的膠原海綿小塊上,然后放置于預加有培養(yǎng)基的24孔板中,培養(yǎng)過夜.4.加入含藥物的培養(yǎng)基,每個濃度2個平行孔.5.繼續(xù)培養(yǎng)3天后,加入MTT,孵育4h,然后提取還原的MTT,測定

570nm的OD值.6.藥物處理組和對照組進行比較,計算抑制率,評價藥物殺傷.第29頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月腫瘤組織的處理第30頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)中的腫瘤組織(一)培養(yǎng)孔培養(yǎng)基液面腫瘤組織膠原海綿第31頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)中的腫瘤組織(二)第32頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月HDRA培養(yǎng)腫瘤組織形態(tài)結(jié)構第33頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月MTT還原法測定細胞活力第34頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)果評價加藥處理組(T)空白對照組(C)抑制率(I)=T/C敏感藥物:I>50%第35頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月HDRA技術特點1.腫瘤組織不需要進行機械/酶學分散,保持其結(jié)構及形態(tài),減少操作造成的細胞損失.2.模擬體內(nèi)藥物對癌組織的作用,評價客觀,同時避免了僅進行癌細胞評價的片面性.3.該技術采用天然膠原海綿作為培養(yǎng)基質(zhì),同時培養(yǎng)的組織接近液面,促進氣液交換,保證癌細胞的生長增殖.4.具有較高的標本可評價率,據(jù)報道為90-100%.

第36頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月HDRA技術歷史和現(xiàn)狀1.Hoffman等人于80年代末期建立基于膠原海綿的立體組織培養(yǎng)技術,后應用于原代瘤組織體外藥敏檢測至今已有10余年的歷史。2.目前該技術主要在日本和美國進行大量的臨床應用研究,公開發(fā)表文獻50余篇。3.2002年Singh等人在頭頸部腫瘤中的研究表明,該技術能夠評價患者預后,從而指導腫瘤化學治療。第37頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月胃腸癌生存預后Kaplanmiere生存曲線第38頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月四、膠滴腫瘤藥敏檢測技術膠滴腫瘤藥敏檢測技術（collagengeldropletculturedrug-sensitivitytest，CD-DST）突出特點是能夠排除成纖維細胞對實驗的干擾，在體外對抗癌藥物的特異性殺傷作用做出客觀評價，細胞用量少，標本培養(yǎng)成功率高，采用圖像軟件系統(tǒng)分析結(jié)果，客觀準確。這是目前日本科學家提出的很有發(fā)展前景的研究技術。第39頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

體外藥敏檢測技術的臨床應用及要面臨的挑戰(zhàn)

藥敏檢測技術在腫瘤體外藥敏檢測技術在臨床上的應用是提高腫瘤化療水平的重要工具，該技術的應用必然要在某些腫瘤的治療技術、治療觀念和療效等方面產(chǎn)生較大的影響，最終使醫(yī)生在使用常規(guī)化療方案時能夠綜合考慮該患者體外藥敏實驗的結(jié)果，用藥更加準確，使患者得到更加合理有效的治療，盡可能降低無效治療的機會。

然而，作為一種新的藥敏檢測技術的應用勢必要有一個廣大醫(yī)生認識、認可、接受乃至修正的過程，甚至該技術會受原有藥敏檢測技術和不合理經(jīng)營的影響。腫瘤研究工作精深繁復，耗費巨大，病例資源稀缺，要想在腫瘤治療的道路上走得更遠，無私合作，精誠團結(jié)，高效利用和節(jié)約資源，才會有所建樹。第40頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月Thankyouforyourattention!

第41頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月對腫瘤的個體化治療的一些思考

人類對個體化醫(yī)學的認識和發(fā)展，得益于在細胞分子水平對疾病發(fā)病、演進及治療反應的深入研究。一旦解讀了這些分子差異，患病個體就可利用這些信息獲得更為特異、有效的治療，個體化醫(yī)學將對藥物研發(fā)途徑及臨床醫(yī)療實踐產(chǎn)生重大影響。

第42頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

現(xiàn)代臨床腫瘤學中存在相當多的不確定性，這對患者和醫(yī)師