動物細(xì)胞工程-1課件

動物細(xì)胞工程動物細(xì)胞工程常用技術(shù)手段

動物細(xì)胞培養(yǎng):動物細(xì)胞工程的技術(shù)基礎(chǔ)動物細(xì)胞核移植動物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體一、動物細(xì)胞培養(yǎng)概念:從動物機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它們分散成單個細(xì)胞,然后放在適宜的環(huán)境中,讓這些細(xì)胞生長與增殖。理論基礎(chǔ):動物細(xì)胞能夠在體外增殖(一)動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)過程1、取胚胎或幼齡動物活組織或器官,如孵育13d或16d的雞蛋。2、胰蛋白酶使組織分散成單個細(xì)胞,配成懸浮液在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),這個過程叫原代培養(yǎng)。3、原代培養(yǎng)的細(xì)胞分瓶培養(yǎng)叫傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)10代后大部分死亡,少數(shù)能傳到40~50代。其中大部分細(xì)胞又不再分裂而衰老死亡,但少數(shù)細(xì)胞遺傳物質(zhì)改變,并帶有癌變特點,能在培養(yǎng)條件下無限增殖。動物細(xì)胞培養(yǎng)過程的兩個現(xiàn)象細(xì)胞貼壁:懸液中分散的細(xì)胞貼附在瓶壁上生長。接觸性抑制:當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時,細(xì)胞就會停止分裂增殖。細(xì)胞貼壁過程細(xì)胞在貼壁生長過程中,隨著細(xì)胞分裂,數(shù)量不斷增加,最后形成一個單層,此時細(xì)胞間相互接觸,細(xì)胞分裂與生長停止。接觸抑制(二)動物細(xì)胞培養(yǎng)條件1、無菌、無毒的環(huán)境原因:1)離體的動物細(xì)胞失去了機(jī)體免疫系統(tǒng)的保護(hù),特別容易被微生物感染;2)細(xì)胞在代謝過程中積累的產(chǎn)物不能及時排出,容易對自身造成毒害。措施:1)對培養(yǎng)液、操作工具、培養(yǎng)環(huán)境做無菌處理,在培養(yǎng)液中加適量抗生素;2)定期更換培養(yǎng)液。2、適宜的營養(yǎng)物——培養(yǎng)液培養(yǎng)液的成分:葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、促生長因子、維生素、微量元素、動物血清等。適用于培養(yǎng)哺乳動物的典型培養(yǎng)基成分氨基酸精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸維生素生物素、膽堿、葉酸、煙酰胺、泛酸、硫胺素、維生素B6、核黃素鹽類NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2其它葡萄糖、青霉素、鏈霉素、酚紅、全血清3、溫度與pH:溫度:36、5℃

+/-0、5℃

pH值:7、2-7、4。4、氣體環(huán)境:氧氣(細(xì)胞代謝必需)二氧化碳(維持pH),95%空氣加5%CO2混合氣體的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。動物細(xì)胞培養(yǎng)的有關(guān)問題培養(yǎng)的細(xì)胞為什么要取自動物胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織？動物細(xì)胞培養(yǎng)是否體現(xiàn)了細(xì)胞的全能性？為什么？組織細(xì)胞分散用胰蛋白酶,說明細(xì)胞間的連接物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是什么？為什么要用胰蛋白酶,能用胃蛋白酶不？胰蛋白酶的處理時間能否隨機(jī)？為什么？動物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基與植物組織培養(yǎng)基有什么不同？動物細(xì)胞培養(yǎng)基為什么要加動物血清？需要加什么動物血清？為什么？胰蛋白酶會消化細(xì)胞不？胰蛋白酶除了能夠消化細(xì)胞間的蛋白質(zhì)為,長時間作用也會消化細(xì)胞膜蛋白,對細(xì)胞有損傷作用;作用時間太短,細(xì)胞不容易脫落,因此必須控制好作用時間。實際應(yīng)用中的處理:做預(yù)實驗,摸清效果最好時的胰蛋白酶的用量與作用時間。傳代代數(shù)與細(xì)胞的世代是一個概念不？不是一個概念。在細(xì)胞培養(yǎng)時,所說的“第10代細(xì)胞”僅指該細(xì)胞差不多傳代10次;細(xì)胞傳一代后,一般能倍增3-6次,經(jīng)過三個時期,即潛伏期、指數(shù)生長期與平臺期。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到平臺期時,需要進(jìn)行傳代培養(yǎng),否則細(xì)胞會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,甚至死亡。CO2培養(yǎng)箱的作用時什么？細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)箱一般稱為CO2培養(yǎng)箱,氣體環(huán)境95%空氣與5%CO2。作用是維持培養(yǎng)液的Ph。培養(yǎng)時,培養(yǎng)液中加入NaHCO3,來調(diào)節(jié)PH,NaHCO3有釋放CO2的傾向,培養(yǎng)箱中的CO2能夠抑制反應(yīng),因此培養(yǎng)箱中的CO2濃度與培養(yǎng)液中NaHCO3濃度相平衡。假如將CO2改為O2是不行的,氧氣是氧化劑,濃度高會損傷細(xì)胞,培養(yǎng)時還常常加入一些抗氧化劑等。(三)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用生產(chǎn)蛋白質(zhì)生物制品,如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體。培養(yǎng)基因工程中使用的受體細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞用于體外檢測有毒物質(zhì),判斷物質(zhì)的毒性。如檢測致畸、致癌物質(zhì)。培養(yǎng)各種正常的或病變的細(xì)胞,用于生理、病例、藥理等方面研究,為治療與預(yù)防疾病提供理論依據(jù)。如為皮膚大面積燒傷病人培養(yǎng)皮膚細(xì)胞進(jìn)行皮膚移植。ESC典型的不對稱分裂,具慢周期性與高增殖性、ESC的標(biāo)記蛋白是角蛋白K19、

組織工程皮膚是一個極熱門的話題、如體外培養(yǎng)表皮與真皮,用以修補(bǔ)皮膚損傷、

表皮干細(xì)胞、ESC人耳小白鼠組織工程鼻軟骨組織工程耳軟骨熒光標(biāo)記的小鼠細(xì)胞與人細(xì)胞融合實驗原理:細(xì)胞膜的流動性二、動物細(xì)胞融合與單克隆抗體(一)動物細(xì)胞融合概念:是指兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的過程,也叫動物細(xì)胞雜交。融合后形成的具有兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞,稱為雜交細(xì)胞。1、動物細(xì)胞融合的過程具有不同DNA的兩個細(xì)胞滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合(先質(zhì)后核)融合后的雜交細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂問題為什么滅活的病毒可作為誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的誘導(dǎo)劑？不滅活的病毒能作為誘導(dǎo)劑不？

病毒表面含有的糖蛋白與一些酶能夠與細(xì)胞上的糖蛋白發(fā)生作用,使細(xì)胞相互凝聚,細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子與脂質(zhì)分子重新排布,細(xì)胞膜打開,細(xì)胞發(fā)生融合。不滅活的病毒會感染細(xì)胞,不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。仙臺病毒用作融合劑的病毒必須先用紫外線或β-丙內(nèi)酯滅活,以使其感染活性散失,同時保留融合活性。用滅活的仙臺病毒誘導(dǎo)融合的效率高,對各種動物細(xì)胞都適用,同時能在雞胚中大量培養(yǎng)。然而仙臺病毒不穩(wěn)定,保存中融合活性易降低,且制備麻煩,因此實際常用聚乙二醇誘導(dǎo)融合或電場誘導(dǎo)融合。

細(xì)胞融合過程中兩個細(xì)胞膜的變化顯微鏡下的細(xì)胞融合過程

物理方法:離心、振動、電激化學(xué)方法:PEG生物方法:滅活的病毒(如仙臺病毒)誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的常用方法形成雜交細(xì)胞獲得雜種植株結(jié)果物理、化學(xué)方法(同左)滅活的病毒物理(離心、振蕩、電刺激)化學(xué)(聚乙二醇)誘導(dǎo)方法細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性、植物細(xì)胞全能性原理動物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項目植物體細(xì)胞雜交與動物細(xì)胞融合的比較融合前處理用纖維素酶、果膠酶去壁用胰蛋白酶使細(xì)胞分散2、動物細(xì)胞融合的意義與應(yīng)用

意義:突破了有性雜交方法的局限,使遠(yuǎn)緣雜交(種間、屬間、科間、動植物之間)成為估計。

應(yīng)用:用于研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤與生物新品種培育等,特別是利用雜交瘤技術(shù)制造單克隆抗體。(二)單克隆抗體技術(shù)抗體是如何產(chǎn)生的？問題

每一個B淋巴細(xì)胞只合成與分泌一種特異性抗體。產(chǎn)量低、純度低,特異性差、靈敏度低?？贵w的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法的不足:思考:如何大量獲取某一種特定抗體？科勒GeorgesJ、F、K?hler德國巴塞爾免疫研究所

1946年--1995年米爾斯坦CésarMilstein英國英國醫(yī)學(xué)研究委員會

分子生物實驗室1927年--榮獲1984年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎1975年發(fā)明單克隆抗體技術(shù)

設(shè)計方案:一個B淋巴細(xì)胞－－只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細(xì)胞－－能無限增殖單克隆抗體既能分泌特異性抗體，又能無限增殖的雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體制備過程雜交瘤細(xì)胞1雜交瘤細(xì)胞2雜交瘤細(xì)胞3Mab1Mab2Mab3抗原單克隆抗體制備提取單克隆抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)分泌特異性抗體大量增殖滅活仙臺病毒或PEGBBBB瘤瘤瘤瘤１、細(xì)胞融合后培養(yǎng)液中有幾種細(xì)胞？篩選雜種細(xì)胞考慮:雜交瘤細(xì)胞２、制備過程中應(yīng)用哪些細(xì)胞工程技術(shù)手段？細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第一次篩選得到雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞合成DNA有兩條途徑:一為主要途徑,利用糖與氨基酸合成核苷酸,氨基碟呤可阻斷該途徑;二為補(bǔ)救途徑,通過磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)利用次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷合成核苷酸。骨髓瘤細(xì)胞缺乏HGPRT與TK,只能通過一途徑合成核苷酸而增殖。淋巴細(xì)胞具備兩條途徑,但不能無限增殖。使用選擇培養(yǎng)基---HAT培養(yǎng)基,此培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(Hypoxathine)、胸腺嘧啶核苷(Thymidine)、氨基喋呤(Aminopterin)。在HAT培養(yǎng)基中,小鼠瘤細(xì)胞因不能合成核苷酸而死亡,B淋巴細(xì)胞壽命有限也自然死亡,只有雜交瘤細(xì)胞從B細(xì)胞獲得HGPRT或TK基因,表達(dá)得到HGPRT或TK,利用二途徑合成核苷酸而無限增殖,能在HAT培養(yǎng)基上生長繁殖。因此最后存活下來的一定是雜交瘤細(xì)胞。第二次篩選出一個只產(chǎn)生特異抗體的雜交瘤細(xì)胞。陽性克隆篩選:用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢驗特異性抗體單克隆抗體的擴(kuò)大生產(chǎn):(1)腹腔積液型(2)細(xì)胞生物反應(yīng)器單克隆抗體的概念單:單個細(xì)胞克隆:無性繁殖抗體:化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)單克隆抗體的概念:是指單個雜交瘤細(xì)胞無性繁殖(克隆)形成的細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體的優(yōu)點特異性強(qiáng)、靈敏度高、能大量制備①診斷疾病(識別作用,如同位素標(biāo)記單克隆抗體,可診斷腫瘤、心血管畸形等)

單克隆抗體的應(yīng)用優(yōu)點:準(zhǔn)確、高效、簡易、快速②用于治療疾病與運(yùn)載藥物(主要用于癌癥治療,也可運(yùn)載藥物,如“生物導(dǎo)彈”)(導(dǎo)向作用,作為載體,生物導(dǎo)彈=單克隆抗體+藥物,治療腫瘤)(位置準(zhǔn)確、療效高、副作用小)人的單克隆抗體生產(chǎn)存在許多問題:①致敏問題人們努力尋求的抗體往往是針對有毒抗原的,無法直截了當(dāng)用如此的抗原去刺激某人體,并試圖獲得相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞。②雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定目前世界上已建立一些人骨髓瘤細(xì)胞株,它們與人的淋巴細(xì)胞融合后也能產(chǎn)生抗體,然而未能獲得像小鼠骨髓瘤系那樣理想的株系。產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞存在也不夠穩(wěn)定,抗體效價也不夠理想。③抗體的生產(chǎn)問題已建株的細(xì)胞在體外培養(yǎng)較困難,若能在體內(nèi)培養(yǎng)則較容易,這關(guān)于動物能夠,然而用人的腹腔液培養(yǎng)就不估計。④轉(zhuǎn)化細(xì)胞不穩(wěn)定用病毒轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞細(xì)胞也可建立細(xì)胞株系,但傳代后只有小部分細(xì)胞分泌特異抗體,且細(xì)胞隨傳代遞減,特別難建立起長期穩(wěn)定的細(xì)胞株。人—鼠細(xì)胞雜交也能夠,但隨著細(xì)胞的分裂,人的染色體會大量丟失。問題我們能否利用類似植物組織培養(yǎng)獲得完整植物體的方法培養(yǎng)動物細(xì)胞,使其發(fā)育成一個完整的個體？

不能,高度分化的植物細(xì)胞仍保持著全能性,而動物細(xì)胞的全能性會隨細(xì)胞分化程度的提高逐漸受到限制,分化潛能逐漸變?nèi)?。因此目前還不能利用類似植物組織培養(yǎng)的方法獲得完整的動物體。多莉與威爾莫特三、動物體細(xì)胞核移植與克隆動物概念:將動物的一個細(xì)胞(供體細(xì)胞)的細(xì)胞核,移入另一個差不多去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞(受體細(xì)胞)中,使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體。理論基礎(chǔ):動物細(xì)胞(核)的全能性克隆動物:用核移植方法培育的動物。(一)哺乳動物核移植的類型

胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植容易困難(二)體細(xì)胞核移植的過程(以高產(chǎn)奶牛為例)體細(xì)胞培養(yǎng)取出核甲牛乙牛MⅡ卵母細(xì)胞去除核去核卵母細(xì)胞重組卵細(xì)胞核植入卵裂早期胚胎代孕母牛丙移植體細(xì)胞群克隆牛細(xì)胞核移植胚胎移植物理或化學(xué)方法激活顯微操作儀細(xì)胞核的吸取1切開卵母細(xì)胞透明帶2擠出卵母細(xì)胞細(xì)胞核3注入供體細(xì)胞核4電融合儀融合培養(yǎng)12345

受體細(xì)胞為減數(shù)分裂第二次分裂中期(MⅡ)的卵母細(xì)胞。重組細(xì)胞需通過物理或化學(xué)方法激活,從而完成細(xì)胞分裂與發(fā)育進(jìn)程。體細(xì)胞核移植的技術(shù)操作過程主要包括核供體細(xì)胞與核受體細(xì)胞的處理與制備、核移植、構(gòu)建重組胚胎、胚胎移植等步驟。問題用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞,這是為什么？

培養(yǎng)的動物細(xì)胞一般當(dāng)傳代至10～50代左右時,部分細(xì)胞核型估計會發(fā)生變化,其細(xì)胞遺傳物質(zhì)也估計會發(fā)生突變,而10代以內(nèi)的細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型。因此,在體細(xì)胞核移植中,為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基礎(chǔ),通常采納傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞。問題利用體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物,是對體細(xì)胞供體動物進(jìn)行了100%的復(fù)制不？為什么？

克隆動物DNA主要來自于供體細(xì)胞核,但其核外還有少量的DNA,即線粒體中的DNA是來自于受體卵母細(xì)胞。因此用體細(xì)胞核移植方法克隆的動物并不是供核動物完全相同的復(fù)制?？寺〖夹g(shù)的設(shè)想是由德國胚胎學(xué)家于1938年首次提出的,1952年,科學(xué)家首先用青蛙開展克隆實驗,之后不斷有人利用各種動物進(jìn)行克隆技術(shù)研究。

自從1996年世界第一只體細(xì)胞克隆動物小羊“多利”誕生后,各種克隆動物如雨后春筍般地紛紛問世。

蛙:青蛙是第一種被用于克隆實驗的動物。1952年,科學(xué)家首次通過從發(fā)育到后期的胚胎中提取細(xì)胞核進(jìn)行克隆實驗,但失敗了。1970年,英國生物學(xué)家用同樣方法嘗試克隆,結(jié)果青蛙卵發(fā)育成了蝌蚪,但它在開始進(jìn)食以后就死亡。

鼠:第一只體細(xì)胞克隆鼠名叫“卡繆麗娜”,1997年10月3日出生。目前日本、英國、美國與意大利等國的科學(xué)家差不多獲得了“克隆的克隆”的第二及第三代克隆鼠。世界克隆動物誕生記牛:能都與加賀是最早的兩頭體細(xì)胞克隆牛,1998年7月5日出生在日本。盡管這兩頭牛早產(chǎn)近40天,但發(fā)育正常。

猴:在目前所有克隆動物中,猴子在基因上與人類最接近。2000年1月,美國科學(xué)家宣稱第一次成功地克隆出靈長類動物———一只名為“泰特拉”的克隆猴。

豬:體細(xì)胞克隆羊與克隆鼠誕生后,科學(xué)家就計劃克隆豬。首批體細(xì)胞克隆豬共5只,出生于2000年3月5日。

貓:2002年初,世界上第一只體細(xì)胞克隆貓誕生了,名為CC。CC的皮毛顏色特別特別,它花白的毛色看上去完全不像