凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)-課件

凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)課程名稱食品分析與檢測技術(shù)授課班級食品1331授課時間2015.4.14授課時數(shù)2本次內(nèi)容測定食品中蛋白質(zhì)教具多媒體教學(xué)目標(biāo)能力（技能）目標(biāo)知識目標(biāo)能對食進(jìn)行預(yù)處理能用開始定氮法測定食品中蛋白質(zhì)了解蛋白質(zhì)測定意義掌握凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)方法了解試驗中各種試劑作用重點蛋白質(zhì)測定原理、步驟難點蛋白質(zhì)測定過程能力訓(xùn)練方式方法講解、問答、互動教學(xué)環(huán)節(jié)時間安排復(fù)習(xí)：5min講解、互動：75min小結(jié)：5min看書鞏固知識點：5min課外作業(yè)預(yù)習(xí)氨基酸態(tài)氮測定課堂考勤45參考資料《食品分析與檢驗技術(shù)》凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)一、概述

蛋白質(zhì)是以氨基酸為最小構(gòu)成單元的大分子的含氮化合物，它是由20種氨基酸通過酰氨鍵以一定方式結(jié)合，并具有一定的空間結(jié)構(gòu)。4生理功能及在食品中的作用1．蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，一切有生命的活體都含有不同類型的蛋白質(zhì)。2．維持酸堿平衡、水平衡；3．遺傳信息的表達(dá)方式；4．維持物質(zhì)的代謝及運轉(zhuǎn)；5．人及動物需要從食品得到蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物，來構(gòu)成自身的蛋白質(zhì)；6．營養(yǎng)指標(biāo)、食品生產(chǎn)工藝指標(biāo)。5常見食物中蛋白質(zhì)的含量牛肉螺旋藻6常見氮系數(shù)78“毒奶粉事件”9（GB/T21704-2008）2008年7月1日實施的《乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定》（GB/T21704-2008）的國家標(biāo)準(zhǔn)，這種檢測方法就是利用三氯乙酸與蛋白質(zhì)結(jié)合形成不溶性鹽，并從水溶液中沉淀出來的性質(zhì)，經(jīng)過過濾將乳制品溶液分為不溶性（沉淀）和可溶性（濾液）兩部分，再利用"凱氏定氮法"測定濾液中氮含量，就可以知道非蛋白氮的含量10凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)（粗蛋白）凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量。。1.原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化(digest)，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出。而樣品中的有機氮(organicnitrogen)轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。1112第一步：樣品消化樣品與濃硫酸加熱消化，硫酸使有機物脫水并破壞有機物，C、H氧化為二氧化碳、水逸出，蛋白質(zhì)分解為氨、與硫酸結(jié)合生成硫酸銨、留在溶液中（1）消化總反應(yīng)式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%）14消化裝置“自動回流消化儀”定氮消化的不同狀態(tài)RCH2(NH2)COOH+H2SO4→CO2+H2O+SO2+(NH4）2SO4澄清消泡碳化消化過程中試劑作用硫酸鉀：提高溶液沸點、加快反應(yīng)進(jìn)程；硫酸銅：催化作用18（1）蒸餾

(NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O(3）吸收與滴定吸收：加熱蒸餾所放出的氨，硼酸溶液滴定：鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，

硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用

硫酸、鹽酸溶液也可。各步驟操作細(xì)節(jié)圖解：樣品消化→蒸餾→滴定（1）樣品消化樣品+0.4g硫酸銅+6g硫酸鉀+20ml濃硫酸+玻珠數(shù)粒先小火炭化，無泡沫后，加大火力，液體變藍(lán)綠透明，繼續(xù)加熱微沸30分鐘45度角消化終點瓶口不能對著人蓋上小漏斗22（2）蒸餾將消化液全部轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示劑2～3d加入NaOH溶液后顏色為深藍(lán)色或褐色通入蒸汽開始蒸餾冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀釋液沿小玻璃杯移入反應(yīng)室，少量蒸餾水沖洗，塞緊棒狀玻璃塞，向小玻璃杯內(nèi)加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH緩慢流入反應(yīng)室，立即塞緊玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。23吸收液變藍(lán)色后繼續(xù)蒸餾5分鐘，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端，取下接收瓶，關(guān)閉電源24（3）滴定取下接收瓶，用0.1000mol/L的鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點。滴定前滴定終點同時做一試劑空白實驗，記錄空白滴定消耗鹽酸的體積。25實驗注意事項—消化（1）不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶、緩和沸騰消化（2）消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘，一般消化時間約4小時（3）可加如少量辛醇、硅油做消泡劑（4）樣品不易澄清時可冷卻后加入30%過氧化氫2-3ml2627自動凱氏定氮儀法在凱氏定氮法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的自動凱氏定氮儀法，具有安全、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點。儀器：消化爐自動蒸餾裝置28

1、原理及適用范圍2、特點：

（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗洠?2分鐘完成1個樣。2930雙縮脲法（分光光度法）1.原理——雙縮脲反應(yīng)

堿性條件下、雙縮脲與硫酸銅作用生成紫紅色配合物的反應(yīng)。

肽鍵（-CO-NH-）與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似、能呈現(xiàn)此反應(yīng)。

560nm處、由顏色深淺判定蛋白質(zhì)含量多少。KOH、CuSO4、酒石酸鉀鈉配置31標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線（standardcurve）是指通過測定一系列已知組分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的某理化性質(zhì)，而得到的性質(zhì)的數(shù)值曲線。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制（1）配置一定濃度（10mg/ml）的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；（2）分別量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液于7支50ml比色管中；（3）向上述7支試管中分別加入1ml四氯化碳后、用堿性