支原體（培養(yǎng)法）檢測程序

支原體檢測（培養(yǎng)法）操作規(guī)程編號：SOP-ZL005-01頁碼：1\5版本：01修訂號：01機密等級：秘密起草人起草日期頒發(fā)部門質(zhì)量管理部審核人審核日期批準人批準日期生效日期分發(fā)清單研發(fā)部[]質(zhì)量管理部[]綜合管理部[]生產(chǎn)管理部[]市場銷售部[]財務(wù)部[]目的指導并規(guī)范直接培養(yǎng)法檢測小牛血清支原體的操作。適用范圍本程序包括初次接種培養(yǎng)、第7天轉(zhuǎn)種培養(yǎng)、結(jié)果判定標準及培養(yǎng)基的最終處理。適用于小牛血清支原體直接培養(yǎng)法檢查的全過程。職責3.1質(zhì)控部負責本程序的起草3.2總經(jīng)理負責本程序的審批3.3質(zhì)控檢驗人員負責本程序的操作定義引用標準《中華人民共和國藥典》四部2015版材料及設(shè)備6.1試劑6.1.1供試品小牛血清，8ml以上6.1.3效期內(nèi)滅活小牛血清，使用前確認批號、有效期，并填寫相應(yīng)記錄。6.1.4陰性對照：無菌生理鹽水（安瓿瓶2ml/瓶）10ml6.2培養(yǎng)基6.2.1效期內(nèi)支原體肉湯培養(yǎng)基8ml/支（中管），4支（初種）和8支（轉(zhuǎn)種）。記錄批號及有效期。6.2.2效期內(nèi)支原體半流體培養(yǎng)基8ml/支（中管），4支（初種）和8支（復種）。記錄批號及有效期。6.3用具1ml刻度吸管、10ml刻度吸管。清洗、滅菌參《玻璃器皿的清洗滅菌程序》6.4設(shè)備6.4.1生物安全柜。6.4.235～37℃孵箱。6.4.3電磁爐6.5其它6.5.1無菌醫(yī)療用品無菌帽、無菌口罩和橡膠檢查手套。記錄批號。6.5.275%酒精棉，參見《75%酒精棉配制程序》SXRS-SOP02-1-0-70。記錄批號。流程圖無內(nèi)容8.1初次接種和培養(yǎng)觀察8.1.1操作前準備——支原體半流體培養(yǎng)基融化：8.1.1.1將支原體半流體培養(yǎng)基放入不銹鋼鍋內(nèi)。8.1.1.2用電磁爐加熱10～15分鐘，使其完全融解。8.1.1.3冷卻至觸摸不燙手8.1.1.4供試品、培養(yǎng)基、小牛血清、滅菌物品、75%酒精棉、記號筆、試管架放在操作間。8.1.1.5標記培養(yǎng)基：用記號筆在支原體肉湯培養(yǎng)基和支原體半流體培養(yǎng)基中管外壁注明陰性對照和供試品名稱、批號、接種日期。8.1.1.6補加滅活小牛血清：8.1.1.6.1用75%酒精棉擦拭小牛血清瓶。8.1.1.6.2無菌開啟瓶塞。8.1.1.6.3吸取滅活小牛血清，每支支原體半流體培養(yǎng)基和支原體肉湯培養(yǎng)基中各加入2ml（培養(yǎng)基:血清為8:2）。8.1.1.6.4直到所有供試品的支原體培養(yǎng)基補加完畢。8.1.2.陰性對照接種：8.1.2.1支原體半流體培養(yǎng)基和支原體肉湯培養(yǎng)基各取4支。8.1.2.2每支分別接種無菌生理鹽水各1ml，塞上相應(yīng)的橡膠塞。8.1.2.3注明陰性對照批號、接種日期、判定日期8.1.3供試品接種：8.1.3.1用吸管吸取供試品接種支原體肉湯培養(yǎng)基4支，1ml/支。8.1.3.2塞上相應(yīng)的橡膠塞。。8.1.3.3另取吸管吸取同樣供試品接種支原體半流體培養(yǎng)基4支，1ml/支。8.1.3.4塞上相應(yīng)的橡膠塞8.1.3.5注明供試品名稱、批號、接種日期。8.1.3.6同樣的方法對下一個供試品進行接種，直到所有供試品接種完成。8.1.3.7置入35～37℃孵箱培養(yǎng)21天，每隔3天觀察1次。8.1.3.8接種后的第7天從4支中取2支進行次代培養(yǎng)。8.1.3.9清場。參見《QC清場管理程序》SXRS-SOP09-1-0-77。填寫試驗記錄和清場記錄。復核人復核并簽字。8.2第7天轉(zhuǎn)種和培養(yǎng)觀察8.2.1所需材料及操作前的準備同8.1.18.2.2在每一個供試品準備轉(zhuǎn)種的8支支原體半流體培養(yǎng)基和8支支原體肉湯培養(yǎng)基中管瓶口寫明所需轉(zhuǎn)種供試品的名稱、批號、轉(zhuǎn)種日期。8.2.3補加滅活小牛血清：參見8.1.1.6項。8.2.4陰性對照接種：參見8.1.2.項。8.2.5供試品轉(zhuǎn)種：于初次接種后的第七天，每種培養(yǎng)基各從4支中取2支進行次代培養(yǎng)。8.2.5.1.用吸管吸取初次培養(yǎng)的支原體半流體培養(yǎng)基加入支原體半流體培養(yǎng)基和支原體肉湯培養(yǎng)基各2支，1ml/支。8.2.5.2用吸管吸取初次培養(yǎng)的支原體肉湯培養(yǎng)基加入支原體半流體培養(yǎng)基和支原體肉湯培養(yǎng)基各2支，1ml/支。8.2.5.3同樣的方法對下一個供試品進行轉(zhuǎn)種，直到所有供試品轉(zhuǎn)種完成。8.2.5.4試管架上貼上標簽，注明供試品名稱、批號、轉(zhuǎn)種日期。8.2.5.5置入35～37℃孵箱，培養(yǎng)21天，每隔3天觀察1次。8.2.5.6初次培養(yǎng)的2支支原體半流體培養(yǎng)基和2支支原體肉湯培養(yǎng)基放回原試管架上繼續(xù)培養(yǎng)14天。8.2.6清場。參見《QC清場管理程序》，填寫清場記錄。8.3試驗結(jié)果評估和記錄8.3.1初次培養(yǎng)至21天時觀察結(jié)果，填寫相應(yīng)記錄。8.3.2轉(zhuǎn)種后培養(yǎng)21天觀察結(jié)果，填寫相應(yīng)記錄。8.3.3判定標準8.3.3.1供試品初次培養(yǎng)、轉(zhuǎn)種后培養(yǎng)、陰性對照均無支原體生長判為合格。8.3.3.2如疑有支原體生長，可取加倍量供試品復試。8.3.3.2.1如無支原體生長，供試品判為合格。8.3.3.2.2如有支原體生長，供試品判為不合格。8.5培養(yǎng)基處理8.5.1觀察結(jié)果之后，除特殊情況需留待觀察或進一步分析的培養(yǎng)基外，本程序使用過的培養(yǎng)基應(yīng)及時高壓滅菌處理。8.5.2消毒后的培養(yǎng)基返回培養(yǎng)基制備室。注意事項9.1.嚴格按照GMP要求規(guī)范操作，以防止檢定結(jié)果不成立。9.2.注意不得混淆不同名稱和批號供試品9.3.使用的計量器具應(yīng)經(jīng)過計量校驗9.4出現(xiàn)超標結(jié)果，應(yīng)在試驗記錄中如實記錄。9.5出現(xiàn)OOS情況，應(yīng)及時報告主管。參見《質(zhì)量檢驗超出標準調(diào)查分析程序》，完成OOS記錄。附錄及派生記錄支原體（培養(yǎng)法）檢測記錄F-SOP-ZL005-01相關(guān)文件《CO2孵箱使用、滅菌及維護程序》《