實(shí)驗(yàn)六目的基因的PCR擴(kuò)增教學(xué)課件

實(shí)驗(yàn)六目的基因的PCR擴(kuò)增6、露凝無(wú)游氛，天高風(fēng)景澈。7、翩翩新來(lái)燕，雙雙入我廬，先巢故尚在，相將還舊居。8、吁嗟身后名，于我若浮煙。9、陶淵明（約365年—427年），字元亮，（又一說(shuō)名潛，字淵明）號(hào)五柳先生，私謚“靖節(jié)”，東晉末期南朝宋初期詩(shī)人、文學(xué)家、辭賦家、散文家。漢族，東晉潯陽(yáng)柴桑人（今江西九江）。曾做過(guò)幾年小官，后辭官回家，從此隱居，田園生活是陶淵明詩(shī)的主要題材，相關(guān)作品有《飲酒》、《歸園田居》、《桃花源記》、《五柳先生傳》、《歸去來(lái)兮辭》等。10、倚南窗以寄傲，審容膝之易安。實(shí)驗(yàn)六目的基因的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)六目的基因的PCR擴(kuò)增6、露凝無(wú)游氛，天高風(fēng)景澈。7、翩翩新來(lái)燕，雙雙入我廬，先巢故尚在，相將還舊居。8、吁嗟身后名，于我若浮煙。9、陶淵明（約365年—427年），字元亮，（又一說(shuō)名潛，字淵明）號(hào)五柳先生，私謚“靖節(jié)”，東晉末期南朝宋初期詩(shī)人、文學(xué)家、辭賦家、散文家。漢族，東晉潯陽(yáng)柴桑人（今江西九江）。曾做過(guò)幾年小官，后辭官回家，從此隱居，田園生活是陶淵明詩(shī)的主要題材，相關(guān)作品有《飲酒》、《歸園田居》、《桃花源記》、《五柳先生傳》、《歸去來(lái)兮辭》等。10、倚南窗以寄傲，審容膝之易安。實(shí)驗(yàn)六目的基因的PCR擴(kuò)增一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理，掌握PCR的基本操作技術(shù)以及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理1、變性：加熱使模板DNA在高溫下（94-95℃）變性，雙

鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。2、退火：在體系溫度降至37-65℃，模板DNA與引物按堿基

配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，使引物與模板鏈3’端結(jié)合，形成部分

雙鏈DNA，即退火階段。3、延伸：體系反應(yīng)溫度升至中溫72℃，耐熱DNA聚合酶以單

鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4

種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA，即引物的延伸階段。5’3’3’5’高溫變性低溫退火中溫延伸不斷循環(huán)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖目的片段模板引物對(duì)二、實(shí)驗(yàn)原理

上述3步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)25～30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106～109倍。

典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、兩條合成的DNA引物、耐熱DNATaq聚合酶。

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理PCR：變性－退火－延伸二、實(shí)驗(yàn)原理PCR二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理溫度（℃）時(shí)間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1、儀器：PCR熱循環(huán)儀、臺(tái)式離心機(jī)、微量移

液器、吸頭、電泳設(shè)備等。2、試劑：10xPCRbuffer、dNTPs（25mM）、Taq

酶（5u/μl）、引物1和2(10pmol/ul)、模板DNA、ddH2O、瓊脂

糖、TAE電泳緩沖液、6×上樣緩沖

液、溴化乙啶染液、等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR反應(yīng)一般在200ul的PCR薄壁管中進(jìn)行。2、反應(yīng)體系（25μl）

ddH2O

18ul10xPCRbuffer（Mg2++）2.5ul

模板DNA1uldNTPs（25mM）1ul

引物1(10pmol/ul)

1ul

引物2(10pmol/ul)

1ulTaq酶(5U/l)

0.5ul25μl3、按下述循環(huán)程序進(jìn)行擴(kuò)增94℃×3分鐘，1個(gè)循環(huán)94℃×30秒，56℃×30秒，72℃×1分鐘，30個(gè)循環(huán)72℃延伸10分鐘4℃保溫4、擴(kuò)增結(jié)束后取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物，利用1.2%瓊脂糖

電泳檢測(cè)DNA擴(kuò)增情況

四、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化1、溫度、循環(huán)參數(shù)：（1）變性溫度和時(shí)間：保證模板DNA解鏈完全是保證整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90～95℃，30～60s，再?gòu)?fù)雜的DNA分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時(shí)間。一般情況下選擇94℃30″，可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

（2）復(fù)性溫度和時(shí)間：

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度的選擇，可根據(jù)引物的長(zhǎng)度和G+C含量確定，長(zhǎng)度在15～25bp之間時(shí)，復(fù)性溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算得到，一般位于40～60℃，30～60s。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。一般情況下選擇55℃30″，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。六、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化六、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

（3）延伸溫度和時(shí)間：一般位于Taq酶最適作用溫度70～75℃之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70～75℃。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，<1Kb，1分鐘足夠；>1Kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間，10Kb片段延伸時(shí)間可達(dá)15分鐘。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，常用72℃1′。

（4）循環(huán)數(shù)：其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20～25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20～30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。六、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化2、MgCl2濃度：

可顯著影響PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性

1.5～2.0mM

過(guò)高：增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率過(guò)低：酶活性顯著下降。

六、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化3、引物：

0.2～1μM

偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯(cuò)配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。引物設(shè)計(jì)原則：總原則是提高擴(kuò)增的效率和特異性六、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化⑴長(zhǎng)度15～30b，過(guò)短特異性降低，過(guò)長(zhǎng)則成本增加，產(chǎn)量也下降。⑵引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量宜在45～55%左右。⑶引物內(nèi)部不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物之間尤其在3’末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不然會(huì)形成引物二聚體。七、引物設(shè)計(jì)原則七、引物設(shè)計(jì)原則⑷引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性(<70%)或少于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。⑸引物的5′末端堿基：并沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物長(zhǎng)度足夠，其5′末端堿基可以不與模板DNA匹配呈游離狀態(tài)。最多可游離10個(gè)堿基并不影響PCR反應(yīng)進(jìn)行。⑹引物的3′末端堿基：原則上要求引物的3′末端與模板DNA一定要配對(duì)，另外3′末端的末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。引物3′末端堿基在錯(cuò)誤配對(duì)時(shí)不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異，最好選T、G、C，而不選A。七、引物設(shè)計(jì)原則

由于PCR靈敏度非常高，所以應(yīng)當(dāng)采取措施以防反應(yīng)混合物受痕量DNA的污染。1.

所有與PCR有關(guān)的試劑，只作PCR實(shí)驗(yàn)用，而不

挪作它用。2.操作中所用的PCR管、離心管、吸管頭等都只能

一次性使用。3.每加一種反應(yīng)物，應(yīng)換新的槍頭。八、注意事項(xiàng)1、PCR反應(yīng)液中主要成分是哪些？在PCR反應(yīng)過(guò)

程中各起什么作用？2、為什么在PCR反應(yīng)過(guò)程中，使用三個(gè)不同的溫

度變化？3、用PCR擴(kuò)增目的基因，要想得到特異性產(chǎn)物需

注意哪些事項(xiàng)？九、思考題引物的設(shè)計(jì)的總原則：擴(kuò)增的效率和特異性長(zhǎng)度：15—30bp堿基盡可能隨機(jī)分布（G+C含量45-55%）引物內(nèi)部不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)兩引物間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在3’端一定要與模板嚴(yán)格配對(duì)5’端可引入突變，加酶切位點(diǎn)等輔助軟件：Primer5，Oligo，DNAsis等引物Tm：DNA分子一半為單鏈，另一半為雙鏈時(shí)的溫度稱為該復(fù)合體的溶解溫度Tm，與G+C含量有關(guān)PCR引物設(shè)計(jì)AKPCDS554......2038引物15’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC3’BamH1CDS5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…………….…………………….……………….……………….CDS

….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’引物2

HindⅢ3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG5’擴(kuò)增條件的優(yōu)化優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)：退火溫度和時(shí)間、變性溫度和時(shí)間優(yōu)化Mg2+濃度模板的純度，優(yōu)化模板濃度優(yōu)化dNTP的濃度優(yōu)化引物濃度PCR儀：熱蓋、升降溫速度、精度PCR管的質(zhì)量等PCR的應(yīng)用目的基因的獲得基因組克隆DNA序列分析RNA分析基因突變基因組的比較研究醫(yī)學(xué)疾病診斷等PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收