核酸化學(xué)課件-002

一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)——DNA分子上核苷酸的排列順序?yàn)g覽書(shū)上關(guān)于基因（組）的概念1.DNA的堿基組成：具有生物種的特異性：不同物種DNA有其獨(dú)特的堿基組成；同一物種不同組織/器官/DNA堿基組成一樣，不受生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)狀況及環(huán)境條件的影響。

（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（高級(jí)結(jié)構(gòu)）（一）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1953年，J.Watson和F.Crick在前人研究工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)DNA結(jié)晶的X-衍射圖譜和分子模型，提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并對(duì)模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測(cè)。1.DNA堿基互補(bǔ)原則DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（雙螺旋）腺嘌呤胸腺嘧啶鳥(niǎo)嘌呤胞嘧啶其他組合易相互排斥例如G:T＊因此，DNA的雙股系藉著A:T和G:C的配對(duì)關(guān)系互相結(jié)合。2.Chargaff定則/堿基等比定律：嘌呤總數(shù)等于嘧啶總數(shù)A+G=C+T；6位上含氨基的堿基=6位上含羰基的堿基；A+C=G+T腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩爾數(shù)相同A=T，胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤的摩爾數(shù)相同C=GDNA分子的堿基組成具有種屬特異性，而不具有組織器官特異性3.二級(jí)結(jié)構(gòu)—B型雙螺旋結(jié)構(gòu)大部分DNA所具有的雙螺旋結(jié)構(gòu)，亦稱(chēng)為B型小溝大溝1.反向，平行，右手螺旋，大溝，小溝5`3`5`3`2.鏈間堿基配對(duì)相連3.每10個(gè)堿基對(duì)上升一周4.疏水堿基位于內(nèi)部5.相鄰堿基平面互相平行，垂直于螺旋軸DNA，雙螺旋，正反向，互補(bǔ)鏈。A對(duì)T，GC連，配對(duì)時(shí)，靠氫鍵，AT2，GC3，十堿基，轉(zhuǎn)一圈，螺距34點(diǎn)中間。堿基力和氫鍵，維持螺旋結(jié)構(gòu)堅(jiān)。（AT2，GC3是指之間二個(gè)氫鍵GC間三個(gè).螺距34點(diǎn)中間即3.4）

在真/原核細(xì)胞皆有證據(jù)顯示短的Z型DNA存在。其他類(lèi)型的DNA雙螺旋Z型DNA左旋、細(xì)長(zhǎng)

雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素提問(wèn)：起穩(wěn)定作用的有哪些力呢？答案：疏水作用力（堿基堆積力）

氫鍵

范德華力（二）RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)RNA是單鏈分子，因此，在RNA分子中，并不遵守堿基種類(lèi)的數(shù)量比例關(guān)系，即分子中的嘌呤堿基總數(shù)不一定等于嘧啶堿基的總數(shù)。RNA分子中，部分區(qū)域也能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，不能形成雙螺旋的部分，則形成突環(huán)。這種結(jié)構(gòu)可以形象地稱(chēng)為“發(fā)夾型”結(jié)構(gòu)。在RNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，堿基的配對(duì)情況不象DNA中嚴(yán)格。G除了可以和C配對(duì)外，也可以和U配對(duì)。G-U配對(duì)形成的氫鍵較弱。不同類(lèi)型的RNA,其二級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯的差異。tRNA中除了常見(jiàn)的堿基外，還存在一些稀有堿基，這類(lèi)堿基大部分位于突環(huán)部分.（含有稀有堿基最多的RNA就是tRNA)RNA中的堿基配對(duì)原則

A-U

G-CA-U

G-C雙螺旋區(qū)發(fā)夾結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)：含短的不完全螺旋區(qū)的多核苷酸鏈；G-U配對(duì)形成的氫鍵較弱tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)四臂四環(huán)結(jié)構(gòu)：氨基酸接受區(qū)、反密碼區(qū)、二氫尿嘧啶區(qū)、TC區(qū)和可變區(qū)。除氨基酸接受區(qū)每個(gè)區(qū)均含有一個(gè)突環(huán)和一個(gè)臂。

(1)氨基酸接受區(qū)

包含有tRNA的3’-末端和5’-末端，3’-末端的最后3個(gè)核苷酸殘基都是CCA，A為核苷。氨基酸可與其成酯，該區(qū)在蛋白質(zhì)合成中起攜帶氨基酸的作用。

(2)反密碼區(qū)

與氨基酸接受區(qū)相對(duì)的一般含有7個(gè)核苷酸殘基的區(qū)域，其中正中的3個(gè)核苷酸殘基稱(chēng)為反密碼(3)二氫尿嘧啶區(qū)該區(qū)含有二氫尿嘧啶。(4)TC區(qū)該區(qū)與二氫尿嘧啶區(qū)相對(duì)，假尿嘧啶核苷—胸腺嘧啶核糖核苷環(huán)(TC)由7個(gè)核苷酸組成，通過(guò)由5對(duì)堿基組成的雙螺旋區(qū)(TC臂)與tRNA的其余部分相連。除個(gè)別例外，幾乎所有tRNA在此環(huán)中都含有TC。(5)可變區(qū)位于反密碼區(qū)與TC區(qū)之間，不同的tRNA該區(qū)變化較大。三、DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)（一）真核細(xì)胞染色體的DNA念珠狀三級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的存在形式提問(wèn)：DNA形成三級(jí)結(jié)構(gòu)及染色體的意義何在？答案：壓縮分子空間人體每個(gè)體細(xì)胞DNA長(zhǎng)2m,細(xì)胞直徑0.1mm,細(xì)胞核0.05mm（二）原核生物以及真核生物細(xì)胞器環(huán)狀DNA的超螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)葉綠體中含有環(huán)狀DNA線(xiàn)粒體中含有環(huán)狀DNA細(xì)菌等原核生物質(zhì)粒染色體固定負(fù)超螺旋（右手拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)）反之，則為正超螺旋自然界通常為負(fù)超螺旋。環(huán)狀DNA右旋第四節(jié)核酸及核苷酸的性質(zhì)一、核酸的溶解性RNA和DNA均微溶于水，不溶于一般的有機(jī)溶劑二、核酸的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)核酸分子中含有酸性基團(tuán)（磷酸基）和堿性基團(tuán)（氨基），也具有兩性性質(zhì)。DNA等電點(diǎn)為4～4.5；RNA等電點(diǎn)為2～2.5三、核酸的紫外吸收性質(zhì)

堿基含有共軛雙鍵獨(dú)特的紫外吸收光譜：最大吸收峰260nm左右——核酸及其組份定性和定量測(cè)定的依據(jù)。四、核酸的變性、復(fù)性1、變性（denaturation）（1）變性的實(shí)質(zhì)某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子高級(jí)結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及生物活性發(fā)生改變。不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級(jí)結(jié)構(gòu)不變降解：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯鍵的斷裂（2）變性因素

高溫（一般＞75℃）—熱變性強(qiáng)酸、堿—酸堿變性強(qiáng)氧化劑尿素（PAGE中DNA）機(jī)理：雙鏈間氫鍵斷開(kāi)，成為兩條單鏈（3）增色效應(yīng)完全變性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA25－40%、RNA約1.1%——這種由于變性或降解引起紫外吸收增加的現(xiàn)象稱(chēng)為增色效應(yīng).實(shí)質(zhì)：堿基暴露RNA變性：從螺旋到線(xiàn)團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒(méi)有DNA明顯DNA變性（4）DNA熱變性的特征變性過(guò)程是“躍變式”的，而非漸變,是一種協(xié)同的過(guò)程。Tm

引起DNA變性的溫度稱(chēng)為熔點(diǎn)——Tm指增色效應(yīng)達(dá)50%時(shí)的溫度DNA變性一半所需的溫度一般DNATm值在85-90C之間。

Tm值大小與下列因素有關(guān)：（1）DNA的均一性：越均一Tm的范圍愈?。?）G－C含量：越多Tm越高經(jīng)驗(yàn)公式：XG+C＝（Tm－69.3）×2.44（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度：愈高Tm愈高不易用稀電解質(zhì)保存DNA

核酸的復(fù)性（renaturation）變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的單鏈重新締合成雙鏈——復(fù)性。復(fù)性的程度、速率與復(fù)性條件有關(guān)：熱變性DNA驟然冷卻（淬火）不能復(fù)性將變性DNA緩慢冷卻（退火）可以復(fù)性DNA復(fù)性分子量越大復(fù)性越難；濃度越大，復(fù)性越容易；DNA復(fù)性也與它本身組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)（有很多重復(fù)序列DNA，復(fù)性也快）。減色效應(yīng)（低色效應(yīng)）——復(fù)性時(shí)紫外吸收減少用Cot1/2表示復(fù)性的速度Co：代表DNA的原始濃度t：復(fù)性時(shí)間Cot1/2復(fù)性一半所需時(shí)間與DNA濃度的乘積單位：mols/L提問(wèn)：為什么核酸有紫外吸光性？答案：堿基含有共軛雙鍵，最大吸收波長(zhǎng)260nm提問(wèn)：什么是DNA的變性？答案：DNA雙螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞提問(wèn)：變性因素有哪些？變性因素：高溫（一般＞75℃）、強(qiáng)氧化劑、強(qiáng)酸、堿、尿素等；變性機(jī)理是什么？機(jī)理：雙鏈間氫鍵斷開(kāi)，成為兩條單鏈；提問(wèn)：什么是核酸的復(fù)性？答案：一定條件下，去除變性因素后，核酸恢復(fù)二級(jí)結(jié)構(gòu)及生物活性的現(xiàn)象。高溫變性緩慢冷卻熱復(fù)性急速冷卻復(fù)性失敗五、核酸的降解

化學(xué)降解（酸/堿水解）和酶解作用于磷酸二酯鍵和糖苷鍵DNA/RNA對(duì)酸/堿耐受程度有差別1、堿水解0.3MNaOH溶液中:RNA磷酸酯鍵被水解生成2’/3’-核苷酸DNA則不受影響無(wú)2’－OH不形成堿水解中間產(chǎn)物2、酸水解糖苷鍵比磷酸酯鍵更易被酸水解；嘌呤堿比嘧啶堿的糖苷鍵對(duì)酸更不穩(wěn)定；對(duì)酸最不穩(wěn)定的：嘌呤與脫氧核糖間糖苷鍵DNA在pH2.8、100℃加熱1h，可除去嘌呤堿形成無(wú)嘌呤酸（apurinicacid，APA）3、酶水解酶分類(lèi)

①根據(jù)底物分為：Dnase、RNase②根據(jù)作用方式：核酸外切酶：從一端（3′/5′）逐個(gè)水解核酸內(nèi)切酶：從中間開(kāi)始在某個(gè)位點(diǎn)切斷③按照作用的化學(xué)鍵磷酸二酯酶（phosphodiesterase）斷3′-OH形成的酯鍵5′-磷酸核苷斷5′-OH形成的酯鍵3′-磷酸核苷磷酸單酯酶（phosphomonoesterase）——切去核酸分子末端磷酸基及核苷酸的磷酸基④其它：對(duì)底物二級(jí)結(jié)構(gòu)的專(zhuān)一性作用于雙鏈核酸：雙鏈酶作用于單鏈：?jiǎn)捂溍?+PyPyPyPyPyPyPuPuPPPPPPPPPP2H2OPPPPPPP2H2OPP++OHOHPPPPPGAGAAAGGCUUC

①牛胰核糖核酸酶（RNaseⅠ）作用：嘧啶核苷3’－磷酸與其它核苷酸連鍵專(zhuān)一性極高的內(nèi)切酶（1）RNase3’嘧啶核苷酸/其結(jié)尾的寡核苷酸++PyPyPyPyPyPyPuPuPPPPPPPPPP2H2OPPPPPPP2H2OPP++OHOHPPPPPGAGAAAGGCUUC

②核糖核酸酶T1（RNaseT1）作用：3’－鳥(niǎo)苷酸與相鄰核苷酸5’－OH連鍵產(chǎn)物：3’－鳥(niǎo)苷酸或以其為末端的寡核苷酸③核糖核酸酶T2（RNaseT2）作用位點(diǎn)為腺苷酸殘基可將tRNA完全降解為3’－腺苷酸結(jié)尾的寡核苷酸（2）DNase（外切酶）①DNaseⅠ：牛胰脫氧核糖核酸酶

Mg2+激活切斷雙鏈或單鏈DNA——以5’－磷酸為末端的寡聚核苷酸②DNaseⅡ：牛脾脫氧核糖核酸酶Mg2+抑制DNA降解為3’－磷酸為末端的寡聚核苷酸（3）其他核酸外切酶牛脾磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶——對(duì)DNA/RNA均有作用六、DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定1、末端終止法——Sanger2’，3’雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成鏈延伸的抑制劑2、化學(xué)法硫酸二甲酯：G斷裂甲酸：A、G均斷裂肼：無(wú)NaCl時(shí)C、T均斷裂有NaCl時(shí)僅C斷裂使甲基化第六節(jié)核酸分析測(cè)定及研究方法一、核酸及其組分含量的測(cè)定1、紫外吸收法核酸及其組分對(duì)紫外線(xiàn)的吸光率與其濃度成正比1個(gè)A～50μg/ml雙螺旋DNA～40μg/mlRNA或單鏈DNA2、定糖法RNA：核糖→糠醛→→綠色物質(zhì)（670-680nm）DNA：脫氧核糖+二苯胺→蘭色物質(zhì)（595-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸3、定磷法核酸純的核酸含磷量為9.5%核酸樣品含1g磷相當(dāng)于10.5g核酸（實(shí)驗(yàn)課）4、瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠能插入DNA分子的堿基間形成復(fù)合物在紫外線(xiàn)照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比，通過(guò)與分子標(biāo)簽比較就可得出待測(cè)DNA分子的大小和含量。二、核酸純度的測(cè)定通常用A260/A280=1.8-2.0作為純度標(biāo)準(zhǔn)純DNA比值1.8，＜1.8Pr污染，＞1.8RNA污染純RNA比值2.0，＜2.0Pr污染，＞2.0異硫氰酸污染。三、常用分子生物學(xué)技術(shù)1、凝膠電泳瓊脂糖～、PAGE～不同構(gòu)象的DNA分子遷移率不同超螺旋＞線(xiàn)狀分子＞開(kāi)環(huán)狀分子2、核酸分子雜交3、印跡技術(shù)4、PCR技術(shù)：變性、退火與延伸核酸的雜交熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時(shí)與同源DNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)；與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的