生物化學課件4：酶

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例如，谷丙轉氨酶催化的氨基轉移反響。2.轉移酶Transferase水解酶催化底物的加水分解反響。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反響3.水解酶Hydrolase裂合酶催化從底物分子中移去一個基團或原子形成雙鍵的反響及其逆反響。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反響。4.裂解酶Lyase異構酶催化各種同分異構體的相互轉化，即底物分子內基團或原子的重排過程。

例如，6-磷酸葡萄糖異構酶催化的反響。5.異構酶Isomerase合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的形成反響。這類反響必須與ATP分解反響相互偶聯(lián)。A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反響丙酮酸+CO2草酰乙酸6.合成酶LigaseorSynthetase三.酶的命名〔1〕根據(jù)其催化底物來命名；〔2〕根據(jù)所催化反響的性質來命名；〔3〕結合上述兩個原那么來命名；〔4〕有時在這些命名根底上加上酶的來源或其它特點。1.習慣命名法2.國際系統(tǒng)命名法系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構型、反響性質,2個底物，底物之間“：〞，水解酶水解2字可省略，最后加一個酶字。例如：(習慣名稱:谷丙轉氨酶)系統(tǒng)名稱:L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉移酶酶催化的反響:谷氨酸+丙酮酸-酮戊二酸+丙氨酸四.酶的編號例如：RNaseT1-------EC3148EC------酶3------水解酶1------脂鍵4------磷酸二酯鍵8------編號〔第8個〕第二節(jié)、酶催化作用的特點一.酶和一般催化劑的共性及酶催化作用特性1.酶和一般催化劑的共性：加快反響速度；不改變平衡常數(shù)；自身不參與反響。2.酶催化作用特性：條件溫和：常溫、常壓、pH=7；高效率：反響速度與不加催化劑相比可提高108～1020，與加普通催化劑相比可提高107～1013；專一性：即酶只能對特定的一種或一類底物起作用。易變敏感性：易受各種因素的影響。酶的活性調節(jié)控制：受在活細胞內受到精細嚴格的調節(jié)控制。酶分子代謝更新：二.專一性1.絕對專一性有些酶只作用于一種底物，催化一個反響，而不作用于任何其它物質。2.相對專一性這類酶對構造相近的一類底物都有作用。3.立體異構專一性簇（基團）專一性鍵專一性旋光異構專一性。幾何異構專一性第三節(jié)、酶的化學本質及組成一.酶的化學本質1.由根本組成單位氨基酸2.具有蛋白質的性質-兩性離解性質等3.具有雙縮脲反響二.酶的組成全酶(holoenzyme〕=酶蛋白+輔因子單成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。（簡單蛋白質）雙成份酶（結合蛋白質）酶酶蛋白（apoenzyme）輔因子（cofacter)輔酶（coenzyme)輔基(prostheticgroup)三.酶的輔因子酶的輔因子是酶的對熱穩(wěn)定的非蛋白小分子物質局部，其主要作用是作為電子、原子或某些基團的載體參與反響并促進整個催化過程。(1)傳遞電子體：如卟啉鐵、鐵硫簇；(2)傳遞氫〔遞氫體〕：如FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸；(3)傳遞?；w：如C0A、TPP、硫辛酸；(4)傳遞一碳基團：如四氫葉酸；(5)傳遞磷酸基：如ATP，GTP；(6)其它作用：轉氨基，如VB6；傳遞CO2，如生物素。第四節(jié)酶分子構造與其生物活性的關系一.酶分子構造根據(jù)構造不同酶可分為單體酶：只有單一的三級構造蛋白質構成。寡聚酶：由多個〔兩個以上〕具有三級構造的亞基聚合而成。多酶復合體：由幾個功能相關的酶嵌合而成的復合體。二.活性中心活性中心：酶分子中直接和底物結合并起催化反響的空間局限〔部位〕。

結合部位(Bindingsite)：酶分子中與底物結合的部位或區(qū)域一般稱為結合部位。催化部位(Catalyticsite):酶分子中促使底物發(fā)生化學變化的部位稱為催化部位。通常將酶的結合部位和催化部位總稱為酶的活性部位或活性中心。結合部位決定酶的專一性，催化部位決定酶所催化反響的性質。調控部位(Regulatorysite):酶分子中存在著一些可以與其他分子發(fā)生某種程度的結合的部位，從而引起酶分子空間構象的變化，對酶起激活或抑制作用三.必須基團酶表現(xiàn)催化活性不可缺少的基團。親核性基團：絲氨酸的羥基，半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基。酸堿性基團：門冬氨酸和谷氨酸的羧基，賴氨酸的氨基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巰基等。親核性基團酸堿性基團第五節(jié)、酶作用的機制一.酶催化作用與反響活化能自由能反應進程產(chǎn)物反應物IIIIIII：酶催化反應活化能II：化學催化劑反應活化能III：無催化反應活化能二.酶催化作用的中間產(chǎn)〔絡合〕物學說在酶催化的反響中，第一步是酶與底物形成酶－底物中間復合物。當?shù)孜锓肿釉诿缸饔孟掳l(fā)生化學變化,中間復合物再分解成產(chǎn)物和酶。E+S====E-SP+E許多實驗事實證明了E－S復合物的存在。E－S復合物形成的速率與酶和底物的性質有關。三.使酶具有高效性的機制1.臨近定向效應在酶促反響中，底物分子結合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，有利于提高反響速度；另一方面，由于活性中心的立體構造和相關基團的誘導和定向作用，使底物分子中參與反響的基團相互接近，并被嚴格定向定位，使酶促反響具有高效率和專一性特點.2.“張力〞和“形變〞底物與酶結合誘導酶的分子構象變化，變化的酶分子又使底物分子的敏感鍵產(chǎn)生“張力〞甚至“形變〞，從而促使酶－底物中間產(chǎn)物進入過渡態(tài)。3.酸堿催化酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反響一般都是廣義的酸－堿催化方式。廣義酸－堿催化是指通過質子酸提供局部質子,或是通過質子堿承受局部質子的作用，到達降低反響活化能的過程。酶活性部位上的某些基團可以作為良好的質子供體或受體對底物進展酸堿催化。His殘基的咪唑基是酶的酸堿催化作用中最活潑的一個催化功能團。廣義酸基團〔質子供體〕廣義堿基團〔質子受體〕4.共價催化催化劑通過與底物形成反響活性很高的共價過渡產(chǎn)物，使反響活化能降低，從而提高反響速度的過程，稱為共價催化。酶中參與共價催化的基團主要包括His的咪唑基，Cys的巰基，Asp的羧基，Ser的羥基等。某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價催化作用。四.酶專一性的機制認為整個酶分子的天然構象是具有剛性構造的，酶外表具有特定的形狀。酶與底物的結合如同一把鑰匙對一把鎖一樣1.鎖鑰假說(lockandkeyhypothesis)該學說認為酶外表并沒有一種與底物互補的固定形狀，而只是由于底物的誘導才形成了互補形狀.2.誘導契合假說〔induced–fithypothesis)第六節(jié)、酶促反響動力學一.底物濃度對酶促反響速度影響底物濃度對酶促反響速度影響在酶濃度，pH，溫度等條件不變的情況下研究底物濃度和反響速度的關系。如右圖所示：在低底物濃度時,反響速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級反響特征。當?shù)孜餄舛鹊竭_一定值時，底物濃度增加，反響速度增加，表現(xiàn)為混合級反響特征當?shù)孜餄舛龋瑤缀跛械拿付寂c底物結合后，反響速度到達最大值〔Vmax〕，此時再增加底物濃度，反響速度不再增加，表現(xiàn)為零級反響。二.米氏方程1913年，德國化學家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學說對酶促反映的動力學進展研究，推導出了表示整個反響中底物濃度和反響速度關系的著名公式，稱為米氏方程。Km—米氏常數(shù)Vmax—最大反響速度三.米氏方程的推導根據(jù)中間產(chǎn)物學說，酶促反響分兩步進展:Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。四.米氏常數(shù)Km的意義1.米氏常數(shù)的含義由米氏方程可知，當反響速度等于最大反響速度一半時,即V=1/2Vmax,Km=[S]上式表示,米氏常數(shù)是反響速度為最大值的一半時的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。2.酶的特征物理常數(shù)不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個重要的特征物理常數(shù)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值。3.表示酶與底物之間的親和程度4.判斷酶的最適底物Km最小的底物5.計算一定速度下的底物濃度V=80%Vmax時，(S)=？由：0.8Km+0.2(S)=(S),0.8Km=0.2(S)(S)=4Km又:V=99%Vmax,(S)=99Km6.了解酶的底物在體內的濃度水平Km≈(S)7.判斷反響的方向Km最小的反響8.判斷抑制作用的類型1.雙倒數(shù)作圖法

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：五.米氏常數(shù)Km的測定測定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法—雙倒數(shù)作圖法。1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/KmV/(S)VmaxVVmax/Km斜率=-Km2.Eadie-Hofstee方程由：方程兩邊乘以Km+（S）/（S）V(Km+（S）/（S）)V=-Km(V/（S）)+VmaxVV/(S)作圖最適溫度第七節(jié)影響酶促反響速度的因素一.溫度對酶反響的影響一方面是溫度升高,酶促反響速度加快。另一方面,溫度升高,酶的高級構造將發(fā)生變化或變性，導致酶活性降低甚至喪失。因此大多數(shù)酶都有一個最適溫度。在最適溫度條件下,反響速度最大。二.pH對酶反響的影響在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常稱此pH為最適pH。速度酶濃度三.酶濃度對酶反響的影響在底物足夠過量而其它條件固定的情況下，并且反響系統(tǒng)中不含有抑制酶活性的物質及其他不利于酶發(fā)揮作用的因素時，酶促反響的速度和酶濃度成正比四.激活劑對酶反響的影響1.概念：但凡能提高酶活力的物質(簡單化合物)都稱為酶的激活劑?！瞐ctivator)。2.成分：其中大局部是一些無機離子和小分子簡單有機物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-、GSH、VitC等；3.功能：1〕.這些離子可與酶分子上的氨基酸側鏈基團結合，可能是酶活性部位的組成局部，2〕.也可能作為輔酶或輔基的一個組成局部起作用；4.特點：1〕.一般情況下，一種激活劑對某種酶是激活劑，而對另一種酶那么不一定是激活劑，可能發(fā)生抑制作用；2〕.對于同一種酶，不同激活劑濃度會產(chǎn)生不同的作用。

五.抑制劑對酶反響的影響〔一〕.酶的抑制作用的概念有些物質能與酶分子上某些必須基團結合〔作用),使酶的活性中心的化學性質發(fā)生改變，導致酶活力下降或喪失，這種現(xiàn)象稱為酶的抑制作用。抑制劑：能夠引起酶的抑制作用的化合物那么稱為抑制劑〔inhibitor)。抑制作用的特點：酶的抑制劑一般具備兩個方面的特點：a.在化學構造上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。b.能夠與酶的活性中心以非共價或共價的方式形成比較穩(wěn)定的復合體或結合物?！捕?抑制作用的類型1.不可逆抑制作用抑制劑與酶反響中心的活性基團以共價形式結合，引起酶的永久性失活。如有機磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。2.可逆抑制作用：抑制劑與酶蛋白以非共價方式結合，引起酶活性暫時性喪失。抑劑可以通過透析等方法被除去，并且能局部或全部恢復酶的活性根椐抑制劑與酶結合的情況，又可以分為三類：〔1〕競爭性抑制：概念：某些抑制劑的化學構造與底物相似，因而能與底物竟爭與酶活性中心結合。當抑制劑與活性中心結合后，底物被排斥在反響中心之外，其結果是酶促反響被抑制了。特點：竟爭性抑制通?？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競爭能力來消除。競爭性抑制可用下式表示：競爭性抑制作用的速度方程：有競爭性抑制劑存在時，Km值增大(1+[I]/Ki)倍，且Km值隨[I]的增高而增大；在[E]固定時，當[S]﹥﹥Km(1+[I]/Ki),Km(1+[I]/Ki)項可忽略不計，那么v=Vmax，即最大反響速度不變。競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖：〔2〕非競爭性抑制：概念：酶可同時與底物及抑制劑結合，引起酶分子構象變化，并導至酶活性下降。由于這類物質并不是與底物競爭與活性中心的結合，所以稱為非競爭性抑制劑。如某些金屬離子〔Cu2+、Ag+、Hg2+〕以及EDTA等，通常能與酶分子的調控部位中的-SH基團作用，改變酶的空間構象，引起非競爭性抑制。特點：非竟爭性抑制不能通過增大底物濃度的方法來消除。非競爭性抑制可用下式表示：非競爭性抑制作用的速度方程：有非競爭性抑制劑存在時，V值減小(1+[I]/Ki)倍，且V值隨[I]的增高而降低；Km值不變。非競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖：〔3〕反競爭性抑制：概念：酶只有在與底物結合后，才能與抑制劑結合，引起酶活性下降。反競爭性抑制可用下式表示：特點：非竟爭性抑制不能通過增大底物濃度的方法來消除。有反競爭性抑制劑存在時，Km和V值均減小(1+[I]/Ki)倍，且都隨[I]的增高而降低。反競爭性抑制作用的速度方程：反競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖：第八節(jié)、酶的別離純化與酶活力測定一.酶的別離純化1.根本原那么提取過程中防止酶變性而失去活性防止強酸、強堿、高溫和劇烈攪拌等要求在低溫下操作參加的化學試劑不使酶變性操作中參加緩沖溶液2.根本操作程序選材：微生物〔微生物發(fā)酵物:胞內酶，胞外酶〕，動物〔動物器臟：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等〕,植物〔木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶等〕。抽提：參加提取液提取。胞內酶先要進展細胞破碎〔機械研磨，超聲波破碎，反復凍融或自溶等〕，別離：先進展凈化處理〔過濾，絮凝，離心脫色〕，再采用沉淀法別離〔鹽析法，有機溶劑沉淀法，超離心等〕。純化：可采用離子交換層析，凝膠過濾，液相色譜，親和色譜和超濾等方法。3.酶的制劑形式固體：枯燥〔冰凍升華，噴霧枯燥，真空枯燥〕液體：溶液4.保存低溫下短期保存0-4℃〔固體〕-20?-70℃〔液體〕二.酶活力的測定1.酶活力概念酶活力：又稱為酶活性，一般把酶催化一定化學反響的能力稱為酶活力，通常以在一定條件下酶所催化的化學反響速度來表示。酶活力可用單位時間內單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量表示，單位為mol/min等。2.酶活力的表示方法-酶活力單位酶活力單位的根本定義為：規(guī)定條件〔最適條件〕下一定時間內催化完成一定化學反響量所需的酶量。據(jù)不同情況有幾種酶活力單位〔activityunit〕或又稱酶單位〔enzymeunit〕國際單位U（Unit）：是以最佳條件或某一固定條件下每分鐘催化生成1μmol產(chǎn)物所需要的酶量為一個酶活力單位?！癒atal”單位：是指在一定條件下1秒鐘內轉化1mol底物所需的酶量。Kat和U的換算關系：1Kat=6×107U，1U=16.67nKat以上的酶單位定義中，如果底物（S）有一個以上可被作用的化學鍵，則一個酶單位表示1分鐘使1μmol有關基團轉化的酶量。如果是兩個相同的分子參加反應，則每分鐘催化2μmol底物轉化的酶量稱為一個酶單位。在“U”和“kat”酶活力單位的定義和應用中，酶催化底物的分子量必須是已知的，否則將無法計算。習慣單位在實際使用中，不同酶有各自的規(guī)定，如：α-淀粉酶活力單位：每小時分解1g可溶性淀粉的酶量為一個酶單位。〔QB546-80〕，也有規(guī)定每小時分解1mL2%可溶性淀粉溶液為無色糊精的酶量為一個酶單位。顯然后者比前一個單位小。②糖化酶活力單位：在規(guī)定條件下，每小時轉化可溶性淀粉產(chǎn)生1mg復原糖〔以葡萄糖計〕所需的酶量為一個酶單位。③蛋白酶：規(guī)定條件下，每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量。④DNA限制性內切酶：推薦反響條件下，一小時內可完全消化1μg純化的DNA所需的酶量。3.酶的比活力比活力:指每mg酶蛋白質/蛋白氮所含的酶活力單位數(shù)。比活力=U或Kat/mg酶蛋白或蛋白氮(U或Kat/ml酶液,或U或Kat/mg酶制劑〕比活力表示酶制劑的純度的一個指標。4.酶活力中心轉換數(shù)酶活力中心轉換數(shù):表示酶的催化中心的活性,單位時間內(sec.)每一催化中心的活性或活性中心所轉換底物的分子數(shù)，或每mol酶活性中心單位時間轉換底物的mol數(shù).轉換數(shù)=k3=Vmax/(E0)5.酶活力測定酶活力測定就是測定一定量的酶，在單位時間內產(chǎn)物(P)的生成〔增加〕量或底物〔S〕的消耗〔減少〕量。即測定時確定三種量：①參加一定量的酶；②一定時間間隔；③物質的增減量。1〕.測定酶活力常有以下幾種方法反響計時法：反響計時必須準確。反響體系必須預熱至規(guī)定溫度后，參加酶液并立即計時。反響到時，要立即滅酶活性，終止反響，并記錄終了時間。終止酶反響。常使酶立刻變性最常用的方法：是參加三氯乙酸或過氯酸使酶蛋白沉淀。也可用SDS使酶變性，或迅速加熱使酶變性。有些酶可用非變性法來停頓反響或用破壞其輔因子來停頓反響。反響量的測定法：測底物減少量或產(chǎn)物生成量均可。在反響過程中產(chǎn)物是從無到有，變化量明顯，極利于測定，所以大都測定產(chǎn)物的生成量2).酶活力測定的分析方法具體物質量的測定，據(jù)被測定物質的物理化學性質通過定量分析法測定。常用的方法有：光譜分析法：酶將產(chǎn)物轉變?yōu)椤仓苯踊蜷g接〕一個可用分光光度法或熒光光度法測出的化合物。化學法：利用化學反響使產(chǎn)物變成一個可用某種物理方法測出的化合物，然后再反過來算出酶的活性。放射性化學法：用同位素標記的底物，經(jīng)酶作用后生成含放射性的產(chǎn)物，在一定時間內，生成的放射性產(chǎn)物量與酶活性成正比。第九節(jié)酶的多樣性一.多酶復合體由幾個功能相關的酶嵌合而成的復合體。二.同工酶催化同一化學反響，構造與性質不同的一類酶如：人乳酸脫氫酶LDH1H47324314100431227.1LDH2H3M2444434250444934.7LDH3H2M2311