生化技術固定化的酶與微生物

生化技術固定化的酶與微生物第1頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

一、固定化的酶與固定化微生物的概念

第2頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月是一類由生物細胞產生的具有催化功能的生物大分子（蛋白質），通常稱作生物催化劑酶:第3頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月固定化酶(inmobilizedenzyme)

是用適當?shù)奈锢?、化學方法把純化的酶固定于一定的空間內，使其成為既保持了本身的特性，又能在連續(xù)反應之后可以回收和重復使用的一種制品

第4頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

是用適當?shù)奈锢?、化學方法把純化的微生物固定于一定的空間內，使其成為既保持了本身的特性，又能在連續(xù)反應之后可以回收和重復使用的一種制品

固定化微生物第5頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月固定化酶和固定化微生物的研究歷史:1916年Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn):有些酶雖然不溶于水，但是仍存在催化活性現(xiàn)象1953年Grubhofer和Schleith真正開始固定化酶的研究1960年之后，Katzir-Katchalski學派對酶的固定方法和固定化酶的理化性質做了大量的工作，并將其成功地應用于工業(yè)生產1969年千煙一郎也成功地將固定化氨基?；笐糜贒L-氨基酸的光學拆分過程，使其反應實現(xiàn)了連續(xù)化1973年千煙一郎研制成了大腸桿菌(E．coli)的固定化細胞，即所謂固定化微生物，并將其用于連續(xù)生產L-天門冬氨酸過程。第6頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

固定化微生物雖然僅較適用于催化小分子物質的轉化，并伴隨發(fā)生分解生成物等副反應，但它工序簡單、穩(wěn)定性好、酶活力喪失少、成本低廉，以及利用其固有的多酶系統(tǒng)可對有機體的代謝途徑進行研究固定化微生物的特點:

本章將就固定化的酶與微生物的制備方法及其制品的性質和應用進行討論

第7頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月三、固定化酶的制備第8頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）酶固定化的前提條件

酶的活性中心(催化部分)和空間結構(結合部分)的維持是其具有催化活力的必需條件。因此，在制備固定化酶時，要盡可能避免采用劇烈的條件（過高的溫度和鹽濃度、強酸和強堿，以及各種有機溶劑等）處理。否則，酶的催化作用會降低，甚至喪失，或者改變酶對底物的專一性

第9頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

（二）酶的固定化方法

固定化酶制備方法，根據(jù)制備原理分類：第10頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月制備固定化酶的模式圖：

第11頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月1．載體結合法(1)物理吸附法

載體類型：是將酶蛋白吸附到水不溶性的惰性載體上制成固定化酶的過程。制備原理：常為疏松多孔的吸附材料；如：多孔玻璃、活性炭、酸性白土、羥基磷灰石、磷酸鈣凝膠以及淀粉等物質。酶與載體的相互作用較弱，二者之間易于分離。缺點：酶活力不易喪失，蛋白質的空間結構不發(fā)生明顯變化。優(yōu)點：第12頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)離子結合法

載體類型：將酶以離子結合的方式固定到具有離子交換基團的非水溶性載體上制成的固定化酶。制備原理：常為帶各種離子基團的硅膠、纖維素、交聯(lián)葡聚糖和樹脂等物質。酶與載體的結合力不高，且易受緩沖液類型和pH值高低的影響。應用這種固定化酶反應時，溶液的pH值、離子強度、溫度和底物濃度發(fā)生變化，往往可引起酶的脫落。

。缺點：優(yōu)點：操作較簡便、條件較溫和、酶活力不易喪失。第13頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)共價結合法

是將酶的非必需基團(α-氨基，ε-氨基，α、β、γ-羧基，羥基，咪唑基等)通過共價鍵或整合劑偶聯(lián)于固相載體上而制成固定化酶。制備原理：有硅膠、纖維素、瓊脂糖和交聯(lián)葡聚糖，以及聚丙烯酰胺凝膠等物質。酶與載體結合很牢固，使用周期長（該法目前應用較為普遍）。優(yōu)點：載體類型:操作較復雜、條件較劇烈、酶活力喪失較多。缺點：第14頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)偶聯(lián)反應方式類型的不同，可將共價結合法分為：共價結合法重氮法多肽法烷化法縮合劑法載體交聯(lián)法疊氮法鹵化氰法載體共價交聯(lián)法“酶網’’載體法第15頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月●重氮法制備原理：常用載體:先將載體（帶氨基的芳香族化合物R-Y-NH2）用稀鹽酸和亞硝酸鈉（相當于亞硝酸）處理生成重氮鹽化合物，然后與酶蛋白的酚基、咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應(游離氨基也能發(fā)生十分緩慢的反應)，制成固定化酶（形成偶氮化合物）有對氨芐基纖維素、聚氨基聚苯乙烯、3-對-氨苯氧基-2-羥丙酰纖維素、氨基酸共聚物、交聯(lián)葡聚糖-氨茴香酸酯等弱酸性環(huán)境加入酶蛋白，低溫（0~5℃）第16頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月●多肽法

利用肽的合成原理，使酶蛋白和載體之間以肽鍵連接而制成固定化酶的過程。它又分疊氮法和鹵化氰法等第17頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月◆疊氮法先用羧甲基纖維素甲酯與水合肼作用形成酰肼，然后再與亞硝酸反應得到疊氮化合物，再在低溫條件下，該化合物和酶的游離-NH2、-OH和-SH反應形成肽鍵，即偶聯(lián)成固定化酶◆鹵化氰法此法與第七章“親和層析”中親和吸附劑的制備原理相似。先用鹵化氰(常用的是溴化氰CNBr)活化纖維素、交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖等多糖類載體，然后在偏堿性環(huán)境條件下，使載體（基質）與酶（配體）進行偶聯(lián)，即可制成固定化酶

第18頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月●烷基化法制備原理：常用載體:利用蛋白質N末端游離-NH2、Tyr的Ph–OH、Cys的–OH等與含鹵族功能團的非水溶性載體發(fā)生烷基化反應（由酶蛋白取代鹵族功能團）制成固定化酶氯乙酰纖維素、溴乙酰纖維素、碘乙酰纖維素、聚乙二醇碘乙酰纖維素和二氯-S-三嗪基纖維素等。其中二氯-S-三嗪基纖維素是帶正電荷的，它對中性或堿性的酶蛋白、或作用于帶負電荷底物的酶蛋白進行固定化較為有利，用其制備的固定化酶活力較高。第19頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月●縮合劑法

將酶（含-COOH和-NH2）與含-NH2和-COOH的載體（R-NH2

或R-COOH）在縮合劑碳化二亞胺（R1-N=C=N-R2）或伍德沃德試劑K(N-乙基-5-苯異口惡唑-3′-磺酸)作用下進行縮合反應，制成固定化酶制備方法：第20頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月●載體交聯(lián)法

這種制備固定化酶的方法有的地方把它歸到交聯(lián)法。因為它們都是通過一個中間工具“交聯(lián)劑”（如戊二醛等）將酶固定化的。載體交聯(lián)法是在酶與載體之間進行交聯(lián)，使酶固定化；而交聯(lián)法是在酶分子與酶分子之間進行交聯(lián)，制成網狀結構的固定化酶第21頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2、交聯(lián)法

交聯(lián)法是酶分子之間在雙功能基團交聯(lián)劑作用下，相互交聯(lián)呈網狀結構的固定化酶過程。最常用的交聯(lián)劑是戊二醛，它和酶蛋白中的游離氨基形成希夫氏(Schiff)堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)成固定化酶。

此外，順丁烯二酸酐或乙烯共聚物與酶分子在六甲撐二氨作用下，相互間進行反應，亦可制成固定化酶第22頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月3、包埋法定義：就是將酶包裹到高分子凝膠等物質的細微網格中，或包埋到高分子半透膜中制成固定化酶的方法

分類：包埋法根據(jù)包埋分式不同分為網格型和微囊型由于包埋法制備固定化酶的過程中，酶本身不發(fā)生物理化學變化，故其活力回收率較高，適用于固定各種類型的酶。目前應用較多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、天然瓊脂糖和淀粉等，用其制備固定化酶的操作簡單這種固定化酶制品只能應用于底物和產物的分子質量都小的反應中優(yōu)點：缺點：第23頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月第24頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月四、固定化微生物的制備

目前，固定化微生物的制備方法最多的是包埋法，其次是載體結合法和交聯(lián)法；另外，還有用選擇性熱變法制備固定化微生物的，就是將細胞在適當溫度下進行處理，使細胞膜蛋白變性，但不使酶變性而使酶固定與細胞內的方法第25頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

采用包埋法制備的部分固定化微生物及其用途第26頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月五、固定化酶和固定化微生物的性質第27頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）相對活性固定化酶(或微生物)的活力，通常用“相對活力”表示以固定化酶(或微生物)的活力與同樣量游離酶活力之比稱為相對活力；一般用百分數(shù)表示。以游離酶(或微生物)的活力為100作比較

●概念：一般，酶固定化以后，其活性通常會有不同程度的下降第28頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

●酶固定化以后，活性降低的原因：（1）酶蛋白空間構象改變，空間位阻效應增加，而酶的催化活性與其特定的空間結構密切相關；尤其是共價結合法和交聯(lián)法（酶的活性基團參與反應）對空間結構的影響更大（2）酶與載體偶聯(lián)后產生的空間位阻效應降低了酶分子周圍的底物濃度，減少了酶與底物接觸的機會；使反應減慢，表現(xiàn)出酶活力下降（3）包埋法中凝膠通透性的影響，使酶與底物的接觸受到限制

另外，有些固定化酶(或微生物)相對活力的大小，還會受到底物與載體性質、酶的類型、酶量以及制備方法等因素的影響第29頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

（二）活力曲線與最適pH值

固定化酶(或微生物)的活力曲線與最適pH值的變化：酶(或微生物)固定化后，其活力曲線和最適pH值，一般會發(fā)生偏移活力曲線和最適pH值偏移的原因：①酶固定化后，部分氨基酸側鏈和酶分子的凈電荷發(fā)生了改變，隨之酶活性基團的解離值(pK)也改變；而酶的活性與其解離狀態(tài)相關；②由于載體的理化性質受到影響，致使固定化酶顆粒擴散層內外的[H+]濃度產生差異，其中多陰離子衍生物載體帶負電荷，最適pH值向堿側偏移，而多陽離子衍生物載體帶正電荷，最適pH值則向酸側偏移；③酶反應產物導致固定化酶顆粒內帶電微環(huán)境的改變（在大多數(shù)情況下，固定化酶的活力曲線要比游離酶陡峭）第31頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月②的解釋：

在固定化酶反應體系中，酶顆粒周圍存在一個極薄的擴散層，帶電的載體使固定化酶微環(huán)境中的帶電狀態(tài)不同與外環(huán)境。帶負電荷的載體會使料液中H+局部集中于擴散層，使固定化酶微環(huán)境的PH值低于外側料液的PH值；為了抵消這種影響，需提高料液的PH值，才能使固定化酶達到最大的催化速度；所以，帶負電荷的載體通常使固定化酶的最適PH值向堿側偏移，而帶正電荷的載體則通常使固定化酶的最適PH值向酸側偏移第32頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月活力曲線和最適pH值偏移的表現(xiàn)第33頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

綜上情況可以看出，酶(或微生物)經固定化后，其活力曲線和最適pH的變化是有一定規(guī)律的。因此，當酶的最適pH與其所處的環(huán)境pH不相同時，可通過選擇適當?shù)妮d體進行固定，以改變其最適p值，使之與環(huán)境相一致，從而使固定化酶活力達到最大。第34頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

特點：①固定化酶的穩(wěn)定性一般都優(yōu)于游離酶；②固定化微生物的穩(wěn)定性，基本上與固定化酶相近。

固定化酶穩(wěn)定性提高的原因可能是：帶電荷載體與酶分子之間產生了靜電作用，對酶的特定空間構象起到穩(wěn)定作用蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化現(xiàn)象發(fā)生固定化以后，由于空間位阻，降低了變性劑、解離劑、有機溶劑等對酶的進攻破壞作用（三）穩(wěn)定性第35頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月第36頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）米氏常數(shù)●米氏常數(shù)（K

m）是酶的一個特征性常數(shù)，每一種酶都有一定的K

m值，其倒數(shù)1/K

m稱為親和常數(shù)，用來表示酶與底物的親和力；而固定化酶的K

m值和最大反應速度（Vm）常因酶蛋白結構的變化和載體帶電荷的影響而變化。此外，隨著反應體系離子強度的增大，或者載體粒度的增大，米氏常數(shù)也會增大。一般，載體的顆粒越小，固定化酶越接近游離狀態(tài)的酶，米氏常數(shù)就越接近?！窆潭ɑ傅淖畲蠓磻俣扰c游離酶相比，要依具體情況而定。大多數(shù)酶經固定化以后，Vm

變化不大，但也有由于固定化方法不同而有差異的。如：以多孔玻璃為載體共價結合的轉化酶，其Vm

與游離酶相同；但用PEAE凝膠包埋的轉化酶，其Vm卻只相當于游離酶的1/10。第37頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）其他1、PH值的影響：酶用帶正電荷的載體固定時，在偏酸性環(huán)境條件下可增加固定化酶的穩(wěn)定性；相反，酶用帶負電荷的載體固定時，在偏堿性環(huán)境條件下可增加固定化酶的穩(wěn)定性2、酶固定化以后，抗氧化能力增強3、固定化微生物，如含精氨酸脫亞胺酶的惡臭假單包菌，用PEAE凝膠包埋后，由于細胞膜結構發(fā)生改變，導致其對底物（S）和產物（P）的選擇性喪失，從而提高了固定化微生物的相對活力第38頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月六、應用

固定化酶(或微生物)比游離酶(或自然微生物)不但穩(wěn)定性好，而且與底物和產物更容易分開，所以在工業(yè)、醫(yī)學、藥學和生化分析等方面的應用發(fā)展較快第39頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

（一）工業(yè)方面應用

由于酶固定化以后，既穩(wěn)定，又容易與S和P分離，并且可以重復使用；所以固定化酶在工業(yè)上的應用既經濟又實用第40頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月例1、L-氨基酸的生產是利用固定化氨基?；阜磻M行的生產步驟：先將氨基?；肝接贒EAE-交聯(lián)葡聚糖A-25，制成固定化酶反應柱，在柱中通入DL-氨基酸的N-酰化衍生物，然后采用溶解度法把L-氨基酸和酰化-D-氨基酸分開（這樣就得到了光學純度好，回首率高的DL-氨基酸）L-苯丙氨酸既是營養(yǎng)增補劑，又是甜味劑阿斯巴甜的主原料第41頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月例2、利用固定化多酶反應柱生產3-磷酸甘油醛

多酶反應柱，從上到下依次分別為用聚丙烯酰胺凝膠包埋的己糖激酶、磷酸己糖異構酶、6-磷酸果糖激酶-1、醛縮酶（裂解酶）。當向反應柱注入一定比例的G、ATP、Mg2+混合時，這些底物原料流經反應柱時，依次被己糖激酶、磷酸己糖異構酶、6-磷酸果糖激酶-1和醛縮酶催化反應，生成3-磷酸甘油醛第42頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）醫(yī)學方面

固定化酶在醫(yī)學方面的應用，目前正在積極的研究和開發(fā)。其中用包埋法制備的固定化酶，在治療酶缺乏癥和代謝異常癥等疾病時，有很好的發(fā)展前景。例1在小白鼠腹腔內，分別注射生理鹽水、游離的和固定化的天冬酰胺酶后，飼養(yǎng)觀察的結果如圖10-8所示

※從圖中可看出：使用游離天冬酰胺酶的藥效時間為2天，而使用固定化天冬酰胺酶的藥效時間為6天，明顯延長了藥效時間第43頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

※機體正常的體細胞能合成足量的Asn供蛋白質合成使用，但白血病病變細胞卻不能合成Asn，必須不斷從血液中攝取Asn供病變細胞蛋白質合成。因此，臨床上應用天冬酰胺酶使Asn水解為Asp，減少血液Asn的含量，使病變細胞蛋白質合成受阻，達到治療的目的第44頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月例2人工腎

尿毒癥患者就是由于腎臟病變，體內的代謝廢物如尿素、尿酸等不能隨尿排出體外，傳統(tǒng)的方法就是“透析”，即利用半透膜將血液中的代謝廢物排除。這種方法病人很痛苦，使用不方便，并且成本很高；而新型人工腎是由微型膠囊脲酶和微型膠囊吸附劑—離子交換樹脂或活性炭構成的，將其裝于體外血管分流器內，并與循環(huán)系統(tǒng)連接，體積約為1立升，可隨身攜帶。并且由于固定化酶可重復使用，離子交換樹脂可再生，所以此法比透析法效率高、成本低、使用方便第45頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）生化分析方面

1．定量分析

定量分析是將固定化酶分別與分光光度計、熒光光度計和微量熱量計等儀器組合起來，進行含量檢測的一種自動分析方法。目前這種分析方法正在臨床檢驗中應用。例如，在固定化膽堿酯酶中，通人一定體積的空氣或水，根據(jù)熒光分析測定結果，便可得知其中對人有害的膽堿酯酶神經毒劑(酶抑制劑)的含量現(xiàn)在國際上已用固定化酶對體液和排泄物中的過氧化氫、尿素、乳酸、葡葡糖和氨基酸等物質進行自動分析測定(見表10-6)。。第46頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2．制作酶電極將固定化酶覆蓋在電極上，或將酶固定在電極上構成的裝置稱酶電極，也稱酶傳感器

3．分析物質的結構

將分析蛋白質和核酸一級結構的蛋白水解酶、羧肽酶、亮氨酸氨肽酶、核酸酶、磷酸二酯酶和磷酸單酯酶等分別制成固定化酶，在應用時比游離酶操作簡單，分離方便4．研究酶的功能和反應機理

采用固定化酶可以研究酶的功能和反應機理第47頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月例如為了研究某些酶的亞單位功能，可將具有4個亞基的醛縮酶固定到瓊脂糖上，制成固定化的醛縮酶(s)。將此酶經含巰基乙醇的8mol／L尿素溶液處理后，得到變性的固定化亞單位(b)。然后經透析和再生，則分別得到了固定化亞單位(c)和再生固定化醛縮酶(d)(見圖10-9)。(a)、(c)和(d)三者的比活力分別為4.5、1.6和2.2u／mg蛋白。這表明構成醛縮酶的亞基(即亞單位)是有酶活性第48頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月5．制備親和吸附劑

有些物質如酶和底物(或競爭性抑制劑)、抗原和抗體、激素和受體蛋白、DNA和RNA等具有某些生物學特性，即每一對物質之間存在著很高的特異結合能力。如果將酶用適當?shù)妮d體固定后，制成的親和吸附劑就能把類似底物從混合物中分離出來。

第49頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）應用實例固定化5′-磷酸二酯酶的制備(重氮法)

材料準備酶固定化酶活力測定粗酶液的制備雙功能試劑SESA（對β-硫酸酯乙砜基苯胺）的配制載體（葡聚糖凝膠G-200

）的制備載體的活化（制備SESA—葡聚糖凝膠G-200載體）原酶液活力測定

固定化酶活力測定

殘留酶活力測定相對酶活力和回收率的計算

第50頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月1、粗酶液制備將桔青霉菌(Penicilliumcitrium)發(fā)酵液用（NH4）2SO4鹽析，或用的冷乙醇沉淀分離得到酶2、雙功能試劑的預處理

取5gSESA（對β-硫酸酯乙砜基苯胺）加10ml水研磨，隨后慢慢加入含2％Na2CO3的0.1mol／L的NaOH溶液40ml混勻，收集懸液，棄去殘渣。3、載體的處理取10gSephadexG-200(粉末狀150-200目)凝膠，加水200mi浸泡1～2h后，加含2％Na2CO3的0.1mol／LNaOH溶液，室溫放置過夜，使其充分溶脹4、載體的活化將溶脹好的堿性SephadexG-200凝膠置沸水浴中攪拌，當加溫到50℃時，逐漸加入SESA懸液，用含2％Na2CO3的0.1mol／LNaOH溶液調pH值為8，待加溫到80℃時，保持20min，爾后繼續(xù)加溫到90℃，維持6min，接著開始降溫冷卻，并依次