植物組織石蠟切片的制作

植物組織石蠟切片的制作第1頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．熟練掌握石蠟切片的方法。2．掌握永久制片的制作過程，為研究植物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。3．學(xué)會(huì)植物內(nèi)部結(jié)構(gòu)的比較研究方法。第2頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實(shí)驗(yàn)器具與試劑1．器具石蠟切片機(jī)、烘箱、顯微鏡、染色缸、小培養(yǎng)皿、鑷子、毛筆、吸水紙、紗布、載玻片、蓋玻片等。2．試劑10%番紅水溶液、0.5%固綠（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸餾水、甘油、中性樹膠等。

第3頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實(shí)驗(yàn)材料幼嫩植物各部分，根據(jù)季節(jié)選擇材料。

第4頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法石蠟切片法是顯微技術(shù)上最重要、最常用的一種方法。它是把材料封埋在石蠟里面，用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切片，可以切出很薄的切片。凡是精細(xì)的工結(jié)構(gòu)，大都用石蠟切片。全都過程如下：第5頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月1．固定2．洗滌3．脫水與硬化4．脫酒精2．封埋6．切片7．粘片8．脫蠟9．染色10．脫水11.透明12．膠封第6頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)二1、石蠟切片技術(shù)—固定、染色第7頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆罩谱魇炃衅泄潭?、染色、返藍(lán)的基本操作技術(shù)第8頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實(shí)驗(yàn)原理：石蠟切片法：是用石蠟浸透到組織中，并包埋組織，然后用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)將蠟塊切成切片。只是切片中最常用的一種方法。第9頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實(shí)驗(yàn)用品：1．實(shí)驗(yàn)材料：瓜葉菊葉柄，長(zhǎng)壽花幼莖。2．實(shí)驗(yàn)試劑：卡諾固定液、FAA固定液、35%酒精、50%酒精、70%酒精、83%酒精、95%酒精、100%酒精、二甲苯、中性樹膠、2%氨水、愛氏蘇木精染液。3．實(shí)驗(yàn)器具：解剖器，雙面刀片，青霉素小瓶。第10頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)步驟：1．取材：依據(jù)生物組織取材的各項(xiàng)注意事項(xiàng)。2．固定：卡諾固定液、FAA固定液固定24小時(shí)。3．復(fù)水：卡諾固定液（1h）→50%酒精（1h）→愛氏蘇木精染液

FAA固定液→愛氏蘇木精染液第11頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月4．染色（整染）：愛氏蘇木精染液染色，染色時(shí)間視材料不同而有所不同，總之使材料最后染指紅棕色為止，且內(nèi)外均染色均勻。對(duì)于染不好的材料，可加長(zhǎng)染色時(shí)間，還可通過負(fù)壓，超聲波加注浸劑等方法提高染色效率。時(shí)間為1-2天。第12頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月5．返藍(lán)：染好的材料，用自來水沖洗，加2%氨水使材料變?yōu)樗{(lán)色，時(shí)間也因材料的不同而有所不同，好返藍(lán)的材料用水一洗就藍(lán)。第13頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月附：分染：番紅與固綠色法

番紅用l％的水溶液，固綠用0.5％的酒精液(用95％的酒精配制)，染色步驟如下：第14頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月討論和注意點(diǎn)：(1)用番紅和固綠這個(gè)組合染成的切片，木化、栓化和角質(zhì)的細(xì)胞壁，被番紅染成鮮紅色，纖維素的細(xì)胞璧，被固綠成綠色。就維管束來講，木質(zhì)部染紅，韌皮部染綠，區(qū)別極清楚。(2)在50％酒精中脫色，需經(jīng)實(shí)踐，如脫色不夠，綠色難得染好，脫色太過分，做出來的切片，紅色太淡，甚至于全是綠色，失掉了二色染法的用意。第16頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)二2、石蠟切片技術(shù)—脫水、透明、浸蠟、包埋

第17頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆罩谱魇炃衅忻撍?、透明、浸蠟、包埋的基本操作技術(shù)。第18頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實(shí)驗(yàn)用品：1．實(shí)驗(yàn)試劑：35%酒精、50%酒精、70%酒精、83%酒精、95%酒精、100%酒精、二甲苯、石蠟。2．實(shí)驗(yàn)器具：電光紙、電熱恒溫箱、烤片機(jī)、解剖器、盆。第19頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實(shí)驗(yàn)步驟：1．脫水：35%酒精→50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每級(jí)1-2h。70%酒精處可長(zhǎng)期保存。2．透明：1/2二甲苯+1/2100%酒精(1-2h)→純二甲苯(1h)→純二甲苯(1h)3．浸蠟：石蠟先置于60℃的溫箱中，倒入含二甲苯及材料的小瓶中置于38℃溫箱中，放置2-4小時(shí)。第20頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月4．包埋：先提升恒溫箱的溫度至60℃，換純蠟3次，每次1-2h，用硬的電光紙、牛皮紙疊紙盒，置于45-60℃的燙板上，倒入材料，擺放好材料，把標(biāo)簽（正面向外置于底部），補(bǔ)足石蠟，倒好后輕輕的置于冷水盆中，注意底面要接觸盆中涼水，待石蠟全部凝固后可取出晾干，也可在涼水盆中放置過夜。第21頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第22頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)二3、石蠟切片技術(shù)—切片、粘片、脫蠟、透明、封藏第23頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆罩谱魇炃衅星衅?、粘片、脫蠟、透明、封藏的基本操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)用品：1．實(shí)驗(yàn)試劑：95%酒精、100%酒精、二甲苯、蒸餾水、加拿大樹膠。2．實(shí)驗(yàn)器具：切片機(jī)、烤片機(jī)、解剖器、載玻片、蓋玻片、酒精燈、木筷、染色缸。第24頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實(shí)驗(yàn)步驟：1．修塊、粘塊、整修的步驟：①選取所要切片的材料，從包埋的石蠟塊上用單面刀片切割下來，注意不可損傷包埋的組織。②確定切面的方位，用刀片將石蠟塊的四面作初步的整修。保證材料四周都有石蠟包圍。但不可太多。切面的上、下邊平行。第25頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月③點(diǎn)燃酒精燈，并準(zhǔn)備一把舊的解剖刀。④左手大拇指與食指間持整修好的石蠟塊，材料向上用其余三指夾住臺(tái)木。此時(shí)將解剖刀在酒精燈上加溫后，即放在臺(tái)木與石蠟塊之間，因解剖刀已加溫，遇上兩面的石蠟都會(huì)融化，可立即將解剖刀抽出，石蠟塊迅速壓在臺(tái)木上。第26頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月⑤再將解剖刀蘸取少許石蠟碎屑，放在剛才固定的石蠟四周。此時(shí)，解剖刀再加溫，并迅速將石蠟塊四周的碎屑燙平。使石蠟塊牢固地粘在臺(tái)木上。⑥修石蠟塊上下面平行，是切成的蠟帶呈一直線，不彎曲。每個(gè)切片中組織的距離接近。第27頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月2．切片的方法：①準(zhǔn)備下列用具：毛筆、黑色亮光紙②將已固著和整修好的石蠟塊和臺(tái)木裝在切片機(jī)的夾物部分.第28頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月③安裝切片刀，將刀片夾在刀夾上，并調(diào)整好刀的角度。刀的斜度，非常重要，最好先切除的蠟塊試刀，以確定刀的斜度，一經(jīng)調(diào)度適合后，就不要隨便變動(dòng)，以免每次試刀的麻煩。④移動(dòng)刀片固定器，使夾刀部與夾物部之間的距離調(diào)整好，以石蠟塊的表面剛貼近刀口為度，在旋緊切片固定器的螺旋。第29頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月⑤調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置。修整蠟塊，將刀片移近蠟塊，使小蠟塊的下邊與刀鋒平行，如不平行，可調(diào)夾物部上的螺旋。然后把它固定，再轉(zhuǎn)下蠟塊．呈矩形才行。只有平整的蠟塊，才能切出平整的蠟帶。

最后根據(jù)需要，調(diào)整控制切片厚度的機(jī)制。調(diào)度后，把它固定下來。上述四步驟完成后，就可進(jìn)行切片，第30頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月⑦開始切片。右手握旋轉(zhuǎn)輪的手柄，搖動(dòng)一轉(zhuǎn)就可切下一片，切下的蠟片粘在刀口上，待第二片切下時(shí)粘在一起，所以連續(xù)搖動(dòng)就可將切下的蠟片連成一條蠟帶。這時(shí)左手就可持毛筆將蠟帶提起，邊搖邊移動(dòng)蠟帶。轉(zhuǎn)速為每分鐘40-50為宜。第31頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月⑧切成的蠟帶到20-30厘米時(shí)，即以右手用另一只毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放在黑電光紙上?？康兜囊幻孑^光滑，應(yīng)向下，較皺的一面向上。⑨切下的蠟片是否良好，此時(shí)應(yīng)先行檢查。⑩切片工作結(jié)束后，仍將刀片用具擦拭干凈。第32頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月3．貼片：貼附牢固，在染色時(shí)不易脫落；是皺褶的蠟片伸展平整。用具：載玻片、粘片劑、解剖刀、蒸餾水、展片機(jī)及銬片機(jī)。 第33頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月材料切成薄片后，須將切片粘在玻璃片上，加熱展開，這叫粘片。所用載玻片必須清潔才能使用。粘片時(shí)，需把膠液(或稱粘貼劑)置簿玻片上，再取切片，浮置膠液上，然后置烘片臺(tái)上，使切片展開燙平，材料不現(xiàn)皺紋為度。最后將切片依次排好，用濾紙吸去多余水分，同時(shí)以記號(hào)筆在玻片上編號(hào)，放入溫箱中烘干，溫度30～40℃約1小時(shí)即干。常用的膠液有下列三種：第34頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月(1)明膠液：這是粘片最常用的膠液，簡(jiǎn)便優(yōu)良，配法是100毫升純水中，加明膠4毫克，加熱熔化，過濾即得。(2)梅氏蛋白質(zhì)：雞蛋清50ml甘油50m1水楊酸納1g用蛋白與甘油攪拌，同時(shí)加入水楊酸納，調(diào)勻過濾，應(yīng)用時(shí)以濾液15滴，放入純水50毫升中即得。(3)Land氏液：阿拉伯膠1克重鉻酸鉀0.2克純水100毫升

第35頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月方法①將展片機(jī)溫度調(diào)整到35℃，保持恒定。②在載玻片上涂蛋白甘油粘片劑。其法是用細(xì)玻璃棒蘸取一小滴粘片劑，加在載玻片的中央，然后用洗凈的手指（無名指）加以涂抹，范圍不要太廣，也不要太多，以能貼足夠的蠟片為度。蛋白甘油粘片劑的配方：（不適宜用作蛋白觀察）第36頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月③將涂粘片劑的載玻片放在展片機(jī)上，滴加蒸餾水?dāng)?shù)滴，此時(shí)若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀，即表示玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面。④用解剖刀將蠟帶切成小段，每段的長(zhǎng)度應(yīng)以蓋玻片的長(zhǎng)度為準(zhǔn)，一般應(yīng)比蓋玻片短約1/5-2/5。分片應(yīng)從蠟帶交界處分。第37頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月將蠟帶輕輕移到涂有水的載玻片上，蠟片光面應(yīng)向下貼在載玻片上，依次排列整齊。留出右端貼標(biāo)簽處。⑤材料展平后，從展片機(jī)上取下，稍稍傾斜留出多余的水分，用吸水紙吸干背面及周圍多余水分，放于烤片機(jī)（35℃）上烤干水分。第38頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月4.脫蠟：玻片烘干后，須將蠟脫去，才能染色，脫蠟用二甲苯，把烤好的載玻片放于盛二甲苯的染缸中純二甲苯(5-10min)→純二甲苯(5-10min)第39頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月若分染需再經(jīng)酒精入水中，而后染色，其順序如下：

二甲苯→1/2二甲苯十1/2純酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色

以上各級(jí)約需5～10分鐘。5.滴加加拿大樹膠封藏。6．鏡檢：第40頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月石蠟切片的異常及處理一張理想佳良的切片，除組織固定適當(dāng)和染色清晰之外，還應(yīng)具備：薄、平整，無皺褶壓縮，無裂損抓跡及擦痕，同時(shí)貼片排列密集，整齊位置適當(dāng)，透明度好，封片用膠適量，蓋玻片端正，無氣泡等。第41頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月