植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)(2012級(jí))

綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)教學(xué)目的了解植物體內(nèi)脯氨酸含量測(cè)定的意義原理，掌握其測(cè)定方法。掌握蒽酮法測(cè)定可溶性糖的原理和方法。進(jìn)一步認(rèn)識(shí)細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，掌握電導(dǎo)率儀法測(cè)定離體植物葉片的抗逆性的原理與方法。通過(guò)高溫和低溫處理對(duì)生物膜的傷害，加深理解不良環(huán)境對(duì)植物造成的傷害。綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)二、實(shí)驗(yàn)意義植物生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遇到干旱、低溫、淹水、熱害、鹽堿、病蟲害等不良環(huán)境(逆境)。植物有多種抵抗逆境的形態(tài)和生理機(jī)制。在生理上，植物可以通過(guò)維持細(xì)胞膜的完整性，增加脫落酸含量，積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，活性氧平衡、抗逆基因的表達(dá)等方式來(lái)提高植物細(xì)胞對(duì)逆境的抵抗力。其中不良環(huán)境對(duì)植物組織的傷害程度常通過(guò)測(cè)定細(xì)胞膜的通透性來(lái)衡量，而滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸、可溶性糖含量的變化是植物抗逆能力強(qiáng)弱的一項(xiàng)重要生理指標(biāo)。植物發(fā)育受多種環(huán)境因素的影響逆境的種類圖滲透調(diào)節(jié)和非滲透調(diào)節(jié)的比較滲透調(diào)節(jié)表現(xiàn)為細(xì)胞主動(dòng)積累溶質(zhì)，細(xì)胞水勢(shì)低于土壤水勢(shì)，水流入細(xì)胞，使細(xì)胞保持正膨壓。而非滲透調(diào)節(jié)，缺水時(shí)細(xì)胞未主動(dòng)積累溶質(zhì)，細(xì)胞水勢(shì)等于土壤水勢(shì)，細(xì)胞失水雖帶來(lái)溶質(zhì)濃度提高，但膨壓會(huì)消失，并發(fā)生質(zhì)壁分離滲透調(diào)節(jié)是每個(gè)細(xì)胞溶質(zhì)濃度的凈增加，而不是由于細(xì)胞失水、體積變化引起的溶質(zhì)相對(duì)濃度的增加。綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)三、實(shí)驗(yàn)基本原理可溶性糖在硫酸作用下生成糠醛或羥甲基糠醛化合物，糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮作用形成藍(lán)綠色絡(luò)合物(糠醛衍生物)，在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)，其顏色的深淺與糖含量有定量關(guān)系，在625nm波長(zhǎng)下的吸光值與可溶性糖含量成正比。綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)三、實(shí)驗(yàn)基本原理植物組織受到逆境傷害時(shí)，由于膜的功能受損或結(jié)構(gòu)破壞透性增大，細(xì)胞內(nèi)各種水溶性物質(zhì)不同程度的外滲，將植物組織浸入無(wú)離子水中，水的電導(dǎo)率將因電解質(zhì)的外滲而加大，傷害愈重，外滲愈多，電導(dǎo)率的增加也愈大。故可用電導(dǎo)率儀測(cè)定外液的電導(dǎo)率值而得知傷害程度，從而反映植物的抗逆性強(qiáng)弱。綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)四、儀器試劑（一）植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定（309實(shí)驗(yàn)室）1、實(shí)驗(yàn)組玻璃儀器：(1)試管8根(2)彎頸漏斗4個(gè)(3)移液管6根試劑：(1)3%磺基水楊酸(2)甲苯(3)冰乙酸(4)2.5%茚三酮綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)四、儀器試劑（一）植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定（309實(shí)驗(yàn)室）2、標(biāo)準(zhǔn)曲線組玻璃儀器：

(1)試管7根(2)移液管7根試劑：

(1)10ug/ml脯氨酸(2)2.5%茚三酮(3)蒸餾水(4)冰乙酸(5)甲苯綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)四、儀器試劑（二）蒽酮法測(cè)定植物組織中可溶性糖的含量（310實(shí)驗(yàn)室）1、實(shí)驗(yàn)組玻璃儀器：(1)試管8根(2)燒杯和漓管(3)100ml容量瓶4個(gè)(4)漏斗4個(gè)(5)彎頸漏斗4個(gè)試劑：(1)0.1%蒽酮－硫酸水溶液(2)蒸餾水綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)四、儀器試劑（二）蒽酮法測(cè)定植物組織中可溶性糖的含量（310實(shí)驗(yàn)室）2、標(biāo)準(zhǔn)曲線組玻璃儀器：(1)100ml容量瓶6個(gè)(2)試管7根(3)50ml量筒2個(gè)(4)移液管5根試劑：(1)0.1%蒽酮－硫酸水溶液(2)200μg/ml葡萄糖（3）蒸餾水綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)四、儀器試劑（三）電導(dǎo)率儀法測(cè)定離體植物葉片的抗逆性（309、310實(shí)驗(yàn)室）玻璃儀器：50ml三角瓶4個(gè)試劑：蒸餾水綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)五、實(shí)驗(yàn)材料1、小麥、玉米、棉花、蓖麻、煙草、向日葵等農(nóng)作物葉片或葉柄；2、黃瓜、茄子、辣椒、豆角、大白菜、蘿卜等蔬菜綠葉、心葉、菜心、菜幫等；3、八仙花、紅葉石楠、木芙蓉、紫荊、珊瑚樹等園林植物葉片或葉柄；4、楓香、木荷、梧桐、泡桐等林木葉片或葉柄。綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)六、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)學(xué)生自帶玉米、煙草、羊蹄等植物材料利用實(shí)驗(yàn)室條件人為設(shè)置逆境與正常條件形成對(duì)照（如高溫與常溫，低溫與常溫，干旱與保濕等），分析逆境對(duì)以下生理指標(biāo)的影響：（一）植物體內(nèi)游離脯氨酸含量（二）植物組織中可溶性糖的含量（三）植物組織外液電導(dǎo)率值綜合實(shí)驗(yàn)3植物對(duì)逆境的生理響應(yīng)六、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1、考察旱澇對(duì)上述生理指標(biāo)的影響；2、考察冷熱對(duì)上述生理指標(biāo)的影響；3、考察鹽堿對(duì)上述生理指標(biāo)的影響；4、考察病害對(duì)上述生理指標(biāo)的影響；5、考察蟲害對(duì)上述生理指標(biāo)的影響；6、考察環(huán)境污染對(duì)上述生理指標(biāo)的影響；

七、實(shí)驗(yàn)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（一）植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定取2ml脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(空白用H2O)2ml冰乙酸3ml酸性茚三酮試劑搖勻，沸水浴40min520nm比色冷卻，加入5ml甲苯萃取精確稱取剪碎、混勻植物材料，每份0.2～0.5g放入試管，加5ml3％磺基水楊酸溶液沸水浴10min，自來(lái)水冷卻吸取上清液2ml于試管，加2ml冰乙酸加3ml酸性茚三酮試劑搖勻，沸水浴40min冷卻，加入5ml甲苯萃取520nm比色，查標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)1234567葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml)051020304050蒸餾水（ml)100959080706050每管葡萄糖含量(ug/ml)01020406080100七、實(shí)驗(yàn)步驟（二）蒽酮法測(cè)定植物組織中可溶性糖的含量1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取1ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(空白用H2O)加入5ml蒽酮試劑搖勻，沸水浴顯色10min冷卻625nm比色可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（2013年5月21日上午）可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（2013年5月21日下午）可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（2013年5月22日上午）可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（2013年5月22日下午）稱取剪細(xì)、混勻、潔凈植物葉片0.50～1.50g放入試管，加入20ml蒸餾水沸水浴30min，自來(lái)水冷卻上清液、洗液轉(zhuǎn)入100ml容量瓶，定容過(guò)濾部分至三角瓶中，取1ml過(guò)濾液于干燥大試管中加入5ml蒽酮試劑，搖勻沸水浴顯色10min，冷卻625nm比色，查標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液加到試管底部，以免影響結(jié)果用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿注意安全，如外濺，立即用水沖洗和擦洗稱取等重處理、對(duì)照葉圓片（各30片）分別置于三角瓶①、②三角瓶①、②置于干燥器，真空抽氣常溫靜置1h，其間多次搖動(dòng)三角瓶搖勻，用電導(dǎo)率儀測(cè)定各處理和對(duì)照的初電導(dǎo)率值(κ1)沸水浴l0min冷卻，并在室溫下平衡20min放氣后搖晃材料下沉各自加入20ml蒸餾水搖勻，測(cè)終電導(dǎo)率值(κ2)（三）電導(dǎo)率儀法測(cè)定離體植物葉片的抗逆性（一）植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定脯氨酸[ug·g-1]=C×V/A×W其中:C為提取液中脯氨酸含量(ug)；

V為提取液總體積（ml）；

A為測(cè)定時(shí)所吸取的體積（ml）；

W為樣品重（g）。八、結(jié)果與分析（二）蒽酮法測(cè)定植物組織中可溶性糖的含量

可溶性糖含量[%]=C×V×100%/A×W其中:C為標(biāo)準(zhǔn)曲線所得可溶性糖含量（ug·mL-1）

；V為提取液總體積（ml）；

A為測(cè)定時(shí)所吸取的體積（ml）；

W為樣品重（ug）。八、結(jié)果與分析（三）電導(dǎo)率儀法測(cè)定離體植物葉片的抗逆性在電導(dǎo)率測(cè)定中使用蒸餾水，需要在測(cè)定樣品時(shí)同時(shí)測(cè)定空白電導(dǎo)率值，按下式計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率：相對(duì)電導(dǎo)率L=(κ1－κ0)/(κ2－κ0)其中：κ1為葉片的初電導(dǎo)率值；κ2為葉片的終電導(dǎo)率值；κ0為蒸餾水的電導(dǎo)率值。八、結(jié)果與分析（三）電導(dǎo)率儀法測(cè)定離體植物葉片的抗逆性按下式計(jì)算由于低溫或高溫脅迫而產(chǎn)生的電解質(zhì)外滲，稱為傷害度。傷害度(%)=(Lt－Lck)×100%/(1－Lck)其中：Lt為處理葉片的相對(duì)電導(dǎo)率；Lck為對(duì)照葉片的相對(duì)電導(dǎo)率。八、結(jié)果與分析九、注意事項(xiàng)（一）植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定1、配制的酸性茚三酮溶液僅在24h內(nèi)穩(wěn)定，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。2、茚三酮的用量與脯氨酸的含量相關(guān)。當(dāng)脯氨酸含量在10μg?mL-1以下時(shí)，顯色液中茚三酮的濃度要達(dá)到10mg?mL-1，才能保證脯氨酸充分顯色。3、測(cè)定樣品若進(jìn)行過(guò)滲透脅迫處理，結(jié)果會(huì)更顯著。4、此法也可用于干樣中脯氨酸含量的測(cè)定。九、注意事項(xiàng)（二）蒽酮法測(cè)定植物組織中可溶性糖的含量1、分光光度計(jì)、比色杯用水沖洗，擦鏡紙擦凈；比色杯倒液不超2/3；用完后及時(shí)洗凈!2、實(shí)驗(yàn)操作中用強(qiáng)酸注意安全，如外濺，立即用水沖洗和擦洗!3、由于蒽酮與可溶性糖反應(yīng)的呈色強(qiáng)度隨時(shí)間變化，故必須在反應(yīng)后立即在同一時(shí)間內(nèi)比色。九、注意事項(xiàng)（三）電導(dǎo)率儀法測(cè)定離體植物葉片的抗逆性1、CO2在水中的溶解度較高，測(cè)定電導(dǎo)率時(shí)要防止高CO2氣源和口中呼出的CO2進(jìn)