基因克隆的載體質(zhì)粒

基因克隆的載體質(zhì)粒第1頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表基因重組步驟圖解第2頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

載體（vector）是指能攜帶外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具。早期：質(zhì)粒、病毒、噬菌體新增：人工微小染色體、

YAC載體第3頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月作為基因工程的載體，必須具備以下幾個(gè)性能：

1、具備自主復(fù)制的能力；即能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制；2、具有合適的選擇標(biāo)記，便于重組DNA分子的檢測；3、要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，便于外源基因插入；4、載體分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必須區(qū)域，插入其中的外源基因可以象載體的正常組分一樣進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增；5、具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移，避免基因非控制性擴(kuò)增。第4頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第5頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8kbpUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征第7頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)質(zhì)粒（plasmid）載體一、質(zhì)粒定義與其基本特征二、質(zhì)粒的類型三、質(zhì)粒的構(gòu)型（存在形式）四、質(zhì)粒的命名規(guī)則五、質(zhì)粒的不親合性六、質(zhì)粒DNA的分離與純化七、重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體第8頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月一、質(zhì)粒定義與其基本特征質(zhì)粒（plasmid）是一種獨(dú)立于染色體外的能自主復(fù)制的共價(jià)、閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子。主要存在于細(xì)菌中，在霉菌、酵母及動(dòng)、植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有。

大小1~200kb，約103~105kD；

目前用作載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造而成的。第9頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

質(zhì)粒（plasmid）常有1~3個(gè)抗藥性基因，以利于篩選。第10頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、質(zhì)粒的類型（一）根據(jù)質(zhì)粒基因編碼的特性將質(zhì)粒分為五大類：

F質(zhì)粒：又稱F因子、性質(zhì)粒，可轉(zhuǎn)移基因到新受體細(xì)胞；

R質(zhì)粒：含有青霉素或四環(huán)素等抗性基因；AmpR（氨芐青霉素抗性）、TetR（四環(huán)素抗性）。

Col質(zhì)粒：編碼大腸菌素，可以殺死其他細(xì)菌，如存在于E.coli中的ColE1。

降解質(zhì)粒:可以降解特殊的分子如：甲苯，水楊酸。

致瘤質(zhì)粒：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒第11頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）根據(jù)質(zhì)粒自身傳遞的性質(zhì)分為兩大類：

1、結(jié)合型質(zhì)粒：能自我復(fù)制，含轉(zhuǎn)移基因組，可自我控制質(zhì)粒從一個(gè)寄主細(xì)胞傳到另一個(gè)寄主細(xì)胞。如：F質(zhì)粒，部分R質(zhì)粒、Col質(zhì)粒。

2、非結(jié)合型質(zhì)粒：能自我復(fù)制，不含轉(zhuǎn)移基因組，不能自主在細(xì)胞間傳遞。如：R質(zhì)粒、Col質(zhì)粒

第12頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）根據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制特性分為兩大類：

1、嚴(yán)緊型質(zhì)粒：是一類低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，每個(gè)細(xì)胞中僅含有一個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒；

拷貝（數(shù)）是指一種質(zhì)粒在一個(gè)寄主細(xì)胞中存在的數(shù)目。

2、松弛型質(zhì)粒：是高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，>20拷貝/細(xì)胞。該類基因工程中常用。

第13頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月三、質(zhì)粒的構(gòu)型（存在形式）L構(gòu)型：線性DNA（線狀雙螺旋）OC構(gòu)型：開環(huán)DNA（開環(huán)雙螺旋）SC構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)形DNA

（cccDNA）

第14頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月LOCSC不同構(gòu)型質(zhì)粒DNA電泳移動(dòng)速度比較第15頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月四、質(zhì)粒的命名規(guī)則例：pBR322質(zhì)粒載體

“p”表示是一種質(zhì)粒（plasmid）

；

“BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”，或者是實(shí)驗(yàn)室名稱縮寫；“322”表示實(shí)驗(yàn)編號。第16頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月五、質(zhì)粒的不親合性

是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象，也稱作不相容性。彼此不相容的質(zhì)粒屬于同一個(gè)不親合群。主要是由于它們在復(fù)制功能之間的相互干擾造成的。第17頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月六、質(zhì)粒DNA的分離與純化

1、氯化銫密度梯度離心法；

2、堿變性法；

3、微量堿變性法。

第19頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月1.氯化銫密度梯度離心法

1、質(zhì)粒DNA占總DNA的1%～2%；

2、在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；

3、染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形成的EB-DNA復(fù)合物中，EB含量越高，密度會越低。第20頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月流程：首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，EB會嵌入到DNA鏈的堿基中去。在EB達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。

第21頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第22頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月2.堿變性法：

根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。在PH值12.0～12.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會被變性。通過冷卻或恢復(fù)中性PH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA第24頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月堿變性法步驟：1、取1.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀；2、加入100微升冰冷的溶液Ⅰ，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.0,10mMEDTA，4~5mg溶菌酶）靜置5分鐘；3、加入200微升微冷的溶液Ⅱ（0.2NaOH，1.0%SDS）緩緩混勻置室溫5分鐘。

65度水浴一段時(shí)間會加強(qiáng)染色體DNA的變性作用。4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸鈉，振蕩后，冰浴5分鐘。5、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA。第25頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月七、重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體

1、pSC101質(zhì)粒載體；

2、ColE1質(zhì)粒載體；

3、pBR322質(zhì)粒載體；

4、pUC質(zhì)粒載體；第26頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月1.pSC101質(zhì)粒載體一種嚴(yán)緊型復(fù)制的大腸桿菌質(zhì)粒載體。1~2個(gè)拷貝/細(xì)胞；9.09kb，編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（Tetr

）。有HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ

、SalⅠ、XhoⅠ、PvuⅡ、SmaⅠ等核酸內(nèi)切限制酶酶切位點(diǎn)。其中在HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ3個(gè)位點(diǎn)克隆外源DNA，都會導(dǎo)致Tetr

基因失活。是第一個(gè)真核生物的克隆載體。第27頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第28頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體

—

在大腸桿菌中克隆非洲爪蟾DNA

用核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ消化非洲爪蟾的核糖體DNA（rDNA），與EcoRⅠ消化的pSC101質(zhì)粒進(jìn)行重組。在挑取的55個(gè)轉(zhuǎn)化子中，經(jīng)EcoRⅠ酶切，電泳后13個(gè)轉(zhuǎn)化子含有外源片斷。轉(zhuǎn)化率23.6％第29頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月2.ColE1質(zhì)粒載體

松弛型復(fù)制控制的多拷貝的質(zhì)粒，能產(chǎn)生細(xì)菌素。細(xì)菌素對大腸桿菌的正常生命活動(dòng)有抑制作用（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯能量代謝等）。但含有對細(xì)菌素的免疫基因。第31頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月3.pBR322質(zhì)粒載體

“P”表示是一種質(zhì)粒；

“BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實(shí)驗(yàn)編號。第33頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月(Tetr)第34頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月pBR322的構(gòu)建：為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，并具有相對小的分子量、高拷貝數(shù)、外源基因插入不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能、多克隆位點(diǎn)（多種限制酶的單一切割位點(diǎn)）、質(zhì)粒的穩(wěn)定性（克服質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力）

第35頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第36頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月pBR322的結(jié)構(gòu)來源第37頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：

1、具有較小的分子量；

它的分子量為4363bp?？寺≥d體的大小不要超過10kb。

2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。共有24種核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)（單一的）。其中7種內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致Tetr

基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因Ampr有單一的識別位點(diǎn)，第38頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Example:a.在pBR322質(zhì)粒的BamHⅠ或SalⅠ位點(diǎn)插入外源DNA片斷，切斷了tetr基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出AmprTets表型的重組pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入AmpsTets的大腸桿菌細(xì)胞。先涂布在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具Ampr菌落，再將它們涂布于含四環(huán)素的選擇性培養(yǎng)基上。插入外源片斷的重組質(zhì)粒不能在這種培養(yǎng)基上生長。第39頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月BXBBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX第40頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累1000~3000個(gè)拷貝。第41頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

pBR322質(zhì)粒載體的改良為了更加實(shí)用，人們對pBR322質(zhì)粒進(jìn)行了改良，得到許多pBR322質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自具有不同的特點(diǎn)。第42頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月4.

pUC質(zhì)粒載體人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，在pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5’-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ’基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。

第43頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分：

1、來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；

2、氨芐青霉素抗性基因（ampr

）,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的識別位點(diǎn)。

3、大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。第44頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月AmproripUC18(3kb)MCS

(Multiplecloningsites,

多克隆位點(diǎn)）LacpromoterlacZ’第45頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC質(zhì)粒載體的形體圖第46頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)