DB33-T 2408-2021 甘薯莖腐病菌檢疫鑒定方法

ICS

65.020.20CCS

B

1633 DB33/T

2408—2021甘薯莖腐病菌檢疫鑒定方法Detection

identification

of

Dickeya

dadantii 浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)

布DB33/T

2408—2021 本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T

—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第1請(qǐng)注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省種植業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江省植保檢疫與農(nóng)藥管理總站、浙江大學(xué)、浙江省植物保護(hù)學(xué)會(huì)。紅、劉麗華、仇智靈、姚海峰、王榮洲。DB33/T

2408—20211 范圍反應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光PCR材料、器材與設(shè)備、操作步驟和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于甘薯根、莖、葉等植物材料甘薯莖腐病菌的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1甘薯莖腐病菌 the

pathogen

of

stem

root

of

sweet

potatoBacteriaProteobacteria綱（Gammaproteobacteria）、腸桿菌目（Enterobacterales）、果膠桿菌科（Pectobacteriaceae狄克氏菌屬（Dickeya）、達(dá)旦提狄克氏菌(Dickeya

dadantii)。革蘭氏陰性細(xì)菌，菌體短桿狀，大小約為2.36

μm×

0.40

μm，周生鞭毛，可在煙草上激發(fā)過(guò)敏性反應(yīng)（HR）。4 縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。bp：堿基對(duì)（Base

pair）CFU：菌落形成單位（Colony-Forming

Unit）CTAB：溴代十六烷基三甲胺（

）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic

acid）dNTP：脫氧核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside

triphosphate）HR：過(guò)敏性反應(yīng)(Hypersensitive

Reaction)MALDI-TOF

MS：軟電離高分辨飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（

assisted

laser

ionization-time

of

spectrometry）NA：營(yíng)養(yǎng)瓊脂（Nutrient

Agar）NGMNutrient

Agar

Media）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（

chain

reaction）RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（

transcription

polymerase

chain

reaction）Taq：水生噬熱桿菌（

aquaticus）DB33/T

2408—20215 方法原理根據(jù)甘薯莖腐病的菌落形態(tài)特征、田間危害癥狀特征、分子生物學(xué)PCR或反應(yīng)特征、蛋白質(zhì)指紋圖譜特征和致病性測(cè)試結(jié)果等進(jìn)行檢測(cè)鑒定。6 試劑或材料6.16.26.36.46.56.66.76.86.96.10

75

%乙醇。1

%次氯酸鈉。蛋白胨。牛肉浸膏。氯化鈉。瓊脂粉。蔗糖。NA、

培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)基配比按附錄

B

執(zhí)行。PCR

凝膠電泳檢測(cè)試劑，制備方法按附錄

C

執(zhí)行。實(shí)時(shí)熒光

檢測(cè)試劑，制備方法按附錄

D

執(zhí)行。7 儀器設(shè)備7.17.27.37.47.57.67.77.87.97.107.117.127.137.147.157.167.177.18

普通冰箱。超低溫冰箱：最低可設(shè)定溫度

臺(tái)式小型離心機(jī)。低溫高速離心機(jī)。PCR

實(shí)時(shí)熒光定量

電泳儀。水平電泳槽。凝膠成像分析儀。微波爐。電子天平：最小分度值為

1

mg。顯微鏡。恒溫培養(yǎng)箱。超凈工作臺(tái)。滅菌鍋。旋渦振蕩器。移液器。MALDI

質(zhì)譜儀：需具有細(xì)菌鑒定分析模塊及含

D.dadantii

質(zhì)譜數(shù)據(jù)的菌株數(shù)據(jù)庫(kù)。8 甘薯莖腐病菌檢測(cè)流程DB33/T

2408—2021甘薯莖腐病菌檢測(cè)流程圖見(jiàn)圖1。圖1 甘薯莖腐病菌檢測(cè)流程圖9 癥狀觀察對(duì)于植株樣品，參見(jiàn)附錄A中的癥狀描述觀察有無(wú)甘薯莖腐病典型癥狀，對(duì)出現(xiàn)典型癥狀或可疑癥測(cè)試。10 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)10.1 樣品處理10.1.1

A

3

塊～5

mm×

10mm后加入

1

15～30

或

4

℃冰箱

8h

以上，取浸泡液

12000r/min（離心力10

000

g）離心

5

min，1

無(wú)菌水懸浮沉淀，用于

檢測(cè)或直接平板劃線進(jìn)行病菌分離培養(yǎng)，28

℃培養(yǎng)

2

d～3

d，獲得單菌落。10.1.2 對(duì)于無(wú)癥樣品：取

10

塊～20

塊植物材料剪碎，

～200

mL

生理鹽水

4

℃冰箱過(guò)夜，浸泡液

10000r/min（離心力

9000g）離心

20min，1mL

無(wú)菌水懸浮沉淀；12000r/min（離心力

g）離心

5

DNA

和

PCR

檢測(cè)；如

檢測(cè)為陽(yáng)性，將上述檢測(cè)樣品表面消毒，無(wú)菌水洗三次后，加入

100

mL

生理鹽水，室溫浸泡

1

h

或

4

℃冰箱

8

h

以上，浸泡液

000

r/min（9

000

g）離心

20，1mL

2

個(gè)～3

NGM

或

平板涂布

3

個(gè)～5

個(gè)平板分挑取疑似甘薯莖腐病菌單菌落制成10

CFU/mLDB33/T挑取疑似甘薯莖腐病菌單菌落制成10

CFU/mL離，28

℃培養(yǎng)

2

d～3

d。10.1.3 分離培養(yǎng)鑒定：用滅菌接種環(huán)蘸取樣品懸浮液在

或

平板上劃線分離，同時(shí)，將懸浮液進(jìn)行

倍梯度稀釋

3

μL

3

28

℃恒溫培養(yǎng)

2dA10.2或10.3方法進(jìn)一步鑒定。NGM

和

NA

培養(yǎng)基的配方按附錄

B

執(zhí)行。10.2PCR

10.2.1 模板制備樣品DNA的提取可按CTAB方法，也可使用商品化的提取試劑盒提取。提取的核酸用于PCR檢測(cè)或-20

℃保存?zhèn)溆谩?0.2.2 常規(guī)

對(duì)于有癥樣品，以標(biāo)準(zhǔn)菌株做陽(yáng)性對(duì)照，健康植物組織做陰性對(duì)照，雙蒸水作為空白對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)步驟和判定標(biāo)準(zhǔn)按附錄C執(zhí)行。單菌落可制成菌懸液直接進(jìn)行檢測(cè)。10.2.3 實(shí)時(shí)熒光

檢測(cè)步驟按附錄D10.2.2檢測(cè)。10.3 MALDI-TOF

質(zhì)譜鑒定單菌落按MALDI-TOF

MS質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，具體鑒定步驟和判定標(biāo)準(zhǔn)按附錄E10.4 致病性測(cè)試（可選）8對(duì)照為無(wú)菌水接種，保濕1

d，

℃～30

℃，12

h/12

h生長(zhǎng)。接種2

d～4

d后觀察接種位置附近是否出現(xiàn)癥狀。根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)發(fā)病處組織再分離病菌，分離單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，完成驗(yàn)證。11 結(jié)果判定對(duì)于有癥狀樣品，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即判定為檢出甘薯莖腐病菌；無(wú)癥狀樣品或新發(fā)生區(qū)的有癥狀樣品，檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，且分離到病菌，參考致病性測(cè)試結(jié)果，判定檢出甘薯莖腐病菌。其中，PCR檢測(cè)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，選擇本標(biāo)準(zhǔn)10.2.2或的一種進(jìn)行檢測(cè)，任意一種檢測(cè)方法的結(jié)果為陽(yáng)性則判定為檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。分離的疑似甘薯莖腐病菌單菌落鑒定可選用本標(biāo)準(zhǔn)或10.2.3或10.3薯莖腐病菌D.dadantii。12樣品及檢測(cè)結(jié)果保存12.1 樣品保存與處理DB33/T

2408—2021保存期滿后應(yīng)經(jīng)高壓滅菌處理。12.2 菌株保存與處理的菌株應(yīng)及時(shí)滅菌處理。12.3 結(jié)果記錄與資料保存送樣人聯(lián)系方式和聯(lián)系地址、檢測(cè)時(shí)間、地點(diǎn)、方法和鑒定者。疑似癥狀等應(yīng)及時(shí)拍照保存，PCR結(jié)果需有原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及相關(guān)結(jié)果圖片。DB33/T

2408—2021附 錄 A（資料性）甘薯莖腐病菌基本信息A.1 癥狀在甘薯苗期、生長(zhǎng)期至貯藏期均可發(fā)生，可為害薯塊、薯苗、藤蔓、葉柄和葉片。植株早期發(fā)病，出現(xiàn)黑褐色斑，見(jiàn)圖A.1。早期發(fā)病全株枯死。中后期發(fā)病，在病斑部位上端的藤蔓有不定根深入土中發(fā)病斑一般以芽眼為中心圓形，稍凹陷，黑褐色，后逐漸擴(kuò)大引起整薯腐爛，病部軟化腐爛有臭味。圖A.1

甘薯莖腐病癥狀A(yù).2 病原菌形態(tài)及培養(yǎng)性狀病原菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，菌體短桿狀，大小約為2.36

μm×0.4

μm，周生鞭毛，見(jiàn)圖A.2?？稍跓煵萆霞ぐl(fā)過(guò)敏性反應(yīng)（），見(jiàn)圖A.3。病原菌在平板上28

℃培養(yǎng)2

d后，菌落淡土黃色、不透明、2～3mmA.428

℃培養(yǎng)2d煎雞蛋狀，邊緣不整齊，表面略凸起，產(chǎn)生靛藍(lán)，直徑2

mm～3

mm，見(jiàn)圖A.4的右圖。DB33/T

2408—2021圖A.2

D.dadantii

菌體形態(tài)圖圖A.3

煙草過(guò)敏性反應(yīng)DB33/T

2408—2021分離物10

1d，25分離物10

1d，25

℃～NAA.3 接種癥狀830

℃生長(zhǎng)。接種2

d～4

d后觀察接種位置附近是否出現(xiàn)癥狀，見(jiàn)圖。根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)發(fā)病處組織再分離病菌，進(jìn)行PCR檢測(cè)。圖A.5

甘薯藤蔓上的接種癥狀DB33/T

2408—2021附 錄 B（規(guī)范性）培養(yǎng)基B.1 NA

培養(yǎng)基（1L）B.1.1 蛋白胨10

g。B.1.2 氯化鈉5

g。B.1.3 蔗糖5

g。B.1.4 牛肉浸膏3

g。B.1.5 瓊脂粉15

g。B.1.6 蒸餾水1

mL。B.1.7 pH

7.0～，

℃高壓蒸汽滅菌15

min。B.2 NGM

培養(yǎng)基（1

L）B.2.1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（Becton

MD）

g。B.2.2 甘油（1

%

v/v）10

。B.2.3 四水氯化錳0.4

g。B.2.4pH

6.5，

℃高壓蒸汽滅菌10

min。25

μL反應(yīng)體系：10×

Buffer

25

μL反應(yīng)體系：10×

Buffer

μL，

2

μL，dNTP（10

mmol/L）2

μL，正反向引物（10附 錄C（規(guī)范性）常規(guī)

檢測(cè)方法C.1 引物及序列Ddad5

（5’-gtctgcagagcagtatcaatc-3/

Ddad9（5’’）。C.2 反應(yīng)體系2+μmol/L1

μL，模板

1

μL，Taq酶0.2

μL（1

u），ddH2O

15.3

μL。C.3 反應(yīng)程序PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4

℃預(yù)變性3，94

℃變性30s，55

℃退火1，72

℃延伸1個(gè)循環(huán)；72

℃延伸5

min。反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)不同儀器的要求作適當(dāng)調(diào)整。C.4 瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在%bp。C.5結(jié)果判定為陽(yáng)性，否則為陰性。10DB33/T

2408—2021附 錄 D（規(guī)范性）實(shí)時(shí)熒光

檢測(cè)方法D.1 引物、探針及序列D.1.1 引物為Ddad3（5’-acccaggccaccagaagt-3’）/

：5’-gacggtactgttaccgctac-3’。D.1.2 TaqMan探針ADdad（5’

-3’）。D.2 反應(yīng)體系125

μLPCR

Premix

12.5

μL（5

μmol/L）

μLDdad4（5

μmol/L）11

μL，TaqMan探針（10

μmol/L）1

μL，ROX

Reference

Dye

II

0.5

μL，模板DNA

1

μL，ddH2O

8

μL。D.3 擴(kuò)增程序95

℃預(yù)變性10

s；95

15

s，63

℃退火延伸1

，40個(gè)循環(huán)。D.4 結(jié)果判定Ct3535＜Ct值＜40，增加用量至2

μL～5

μLCt35為陰性。11DB33/T

2408—2021附 錄 E（規(guī)范性）MALDI-TOF-MS

鑒定E.1 樣品的準(zhǔn)備和鑒定在NA培養(yǎng)基上28

℃培養(yǎng)h(HC