生物顯微技術(shù)：有關(guān)于免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)

第一節(jié)免疫組織化學(xué)概述應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對(duì)細(xì)胞標(biāo)本或組織切片中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位的定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)或免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)。一、免疫組化技術(shù)的基本原理和分類免疫組化利用抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性這一特性，即先將組織或細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動(dòng)物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。

通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。分類1、按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)法和免疫金銀法等。2、按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法)；與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3、按結(jié)合方式可分為抗原—抗體結(jié)合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中SP法是最常用的方法。二、免疫組織化學(xué)的發(fā)展年代研究者事件1941年Coons實(shí)用免疫熒光技術(shù)1948年Fagraeus進(jìn)一步發(fā)展實(shí)用免疫熒光技術(shù)1970年Sternberger抗體酶標(biāo)記技術(shù)1974年Taylor證實(shí)組織中的漿細(xì)胞免疫組化1975年Kohler和Milstein單克隆抗體技術(shù)1981年HsuABC法90年代以來SP法，原位雜交及原位PCR免疫組化三、免疫組化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1、特異性強(qiáng)

抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示。2、敏感性高

起始階段，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合。3、定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合

該技術(shù)通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)研究的深入是十分有意義的。四、免疫組化技術(shù)的應(yīng)用由于免疫組化具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定位準(zhǔn)確等特點(diǎn)，且能將形態(tài)研究與功能研究有機(jī)地結(jié)合在一起，所以，這門新技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的許多領(lǐng)域。在病理學(xué)研究中，免疫組化技術(shù)的作用和意義更為重要。以腫瘤研究為例，在免疫組化技術(shù)出現(xiàn)以前，對(duì)腫瘤的診斷和分類還局限于細(xì)胞水平，而引入免疫組化技術(shù)后，則使研究的深度提高到了生物化學(xué)水平、分子水平。近年來，伴隨基因探針研究而興起的核酸分子原位雜交技術(shù)也正在蓬勃發(fā)展，更使免疫組化如虎添翼，兩者相得益彰，將研究推進(jìn)到了基因水平。1、確定細(xì)胞類型2、辨認(rèn)細(xì)胞產(chǎn)物3、了解分化程度4、鑒定病變性質(zhì)5、發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶6、探討腫瘤起源或分化表型7、確定腫瘤分期8、指導(dǎo)治療和預(yù)后9、輔助疾病診斷和分類10、尋找感染病因五、免疫組織化學(xué)技術(shù)基本過程（一）選擇抗體抗體的選擇是開展免疫組化最重要環(huán)節(jié)之一。理想的抗體應(yīng)具備特異性強(qiáng)、敏感性高和適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)?，F(xiàn)實(shí)市場(chǎng)銷售的一抗多為即用型，對(duì)抗體的滴度無須摸索，但對(duì)于濃縮型一抗，則應(yīng)摸索出最佳的工作滴度。靈敏度高而極易控制背景的檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒是最為理想也是免疫組化染色優(yōu)劣的關(guān)鍵，根據(jù)免疫組化技術(shù)發(fā)展至今第三代SP試劑盒更優(yōu)于其它試劑盒(ABC、PAP等)。但應(yīng)注意檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)與一抗來源相匹配，否則檢不出目的物。（1）抗體選用：一般來講，多克隆抗體的抗原專一性較差，非特異性反應(yīng)較明顯，效價(jià)不太穩(wěn)定；但多克隆抗體制備簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，抗體效價(jià)較高，稀釋度一般在1∶100~1000之間，適應(yīng)性強(qiáng)，有部分多抗表達(dá)抗原特異性較好。單克隆抗體的抗原專一性強(qiáng)，質(zhì)量和效價(jià)穩(wěn)定，非特異性反應(yīng)較少，標(biāo)記結(jié)果可靠，但單克隆抗體制備復(fù)雜，價(jià)格昂貴，抗體效價(jià)較低，稀釋度在1∶50~100。因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要選擇合適的抗體。（2）抗體分裝：購入的抗體（除非只夠數(shù)次用量）一般需要分裝在多個(gè)安瓿中，根據(jù)月需要量，大致每安瓿含5~20微升。除留下一支現(xiàn)用，其余應(yīng)立即放置低溫冰箱內(nèi)貯存（-20℃以下）。用一支取一支，以免長期保存在4℃冰箱內(nèi)失效。（二）組織處理

1、組織及時(shí)取材和固定

組織標(biāo)本及時(shí)的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵第一步，可有效防止組織自溶壞死，抗原丟失，離體組織應(yīng)盡快的進(jìn)行取材，最好2h內(nèi)。組織塊大小要適中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm。對(duì)于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應(yīng)的固定液，但很難做到這一點(diǎn)，10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進(jìn)行組織固定，但組織固定時(shí)間最好在l2h內(nèi)，一般固定時(shí)間不應(yīng)超過24h。2、組織脫水、透明、浸蠟

組織經(jīng)固定后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時(shí)間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過程中極易脫片，對(duì)免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以無水酒精脫水和二甲苯透明的時(shí)間不宜過長，正常大小的組織無水酒精脫水1h×3次，二甲苯透明1h×2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過65℃。

（三）切片組織得到很好處理后在進(jìn)行切片之前還應(yīng)對(duì)玻璃片進(jìn)行處理，由于我們檢測(cè)抗原是多種多樣的，因染色操作程序復(fù)雜，時(shí)間較長，有些抗原要進(jìn)行各種抗原修復(fù)處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行，要求在貼片前對(duì)載玻片作適當(dāng)處理，必須在清洗干凈的玻片上進(jìn)行粘合劑的處理以防脫片。1、Poly-L-Lysine(多聚左旋賴氨酸)

2、明膠硫酸鉻鉀法

將2.5g明膠加熱溶于500ml蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入0.25g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價(jià)格便宜、方法簡(jiǎn)單，任何實(shí)驗(yàn)都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應(yīng)注意，如果液體變藍(lán)或粘稠狀停用。3、APES(3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)

切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕，如有上述問題的切片在進(jìn)行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，切片厚度一般為3~4μm，切好的切片在60℃溫箱中過夜，注意烤片的溫度不宜過高，否則易使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而產(chǎn)生抗原標(biāo)記定位彌漫現(xiàn)象。（四）抗原修復(fù)

經(jīng)甲醛固定的部分組織細(xì)胞，可使免疫組化標(biāo)記敏感性明顯降低，這是因?yàn)榧兹┕潭ㄟ^程中形成醛鍵或保存的甲醛會(huì)形成羧甲基而封閉部分抗原決定簇。因此，在染色時(shí)，有些抗原需先進(jìn)行修復(fù)或暴露。因此抗原修復(fù)主要用于福爾馬林或多聚甲醛固定的石蠟包埋組織切片。1、抗原熱修復(fù)是以高溫、高壓對(duì)常規(guī)固定的石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)或復(fù)原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測(cè)的一種方法和技術(shù)手段。（1）高壓熱修復(fù)在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進(jìn)行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。（2）煮沸熱修復(fù)電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織片加熱10~15分鐘。（3）微波熱修復(fù)微波加熱法

將切片放入修復(fù)液中微波加熱使溫度在96℃左右，計(jì)時(shí)l0min，在微波爐中停留2min，室溫自然冷卻，PBS洗3min×3次。適用的抗原有：AR、Bax、Bcl-2、C-fos、X-jun、C-kit、C-myc、E-cadherin、ChromograninA、Cyclin、ER、Heatshockprotein、HPV、Ki-67、MDMZ、p53、p34、p16、p15、P-glycoprotein、PKC、PR、PCNA、ras、Rb和TopoismeraseⅡ等。2、酶消化方法（1）胰蛋白酶(Trpsin)

主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的修復(fù)。一般使用濃度為0.1%，37℃作用10min。（2）胃蛋白酶(Pepsin)

主要用于細(xì)胞間質(zhì)或基底膜抗原的修復(fù)。一般濃度為0.4%，37℃作用30min。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen、Complement、Cytokeratin、C-erB-2、GFAP、LCA和LN等。（五）免疫組化染色第二節(jié)幾種常用的免疫組織化學(xué)方法一、免疫熒光方法原理：是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用比較廣。操作：參見書常用的熒光素有：①異硫氰酸熒光素（fluoreceinisothiocyante，F(xiàn)ITC），為黃色、橙黃色或褐黃色結(jié)晶粉末，有兩種異構(gòu)體，易溶于水和酒精等溶劑，分子量為389，最大吸收光譜為490～495urn，最大發(fā)射光譜為520～530urn，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，是最常用的標(biāo)記抗體的熒光素。②四甲基異氰酸羅達(dá)明（tetrametrylrhodarnineisothiocyante，TRITC）是一種紫紅色粉末，較穩(wěn)定，是羅達(dá)明（rhodamine）的衍生物。最大吸收光譜550urn，最大發(fā)射光譜620urn,呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)射的黃綠色熒光對(duì)比鮮明，常用于雙標(biāo)記染色。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡(jiǎn)便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。近年來發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。熒光標(biāo)本不能長期保存以及需要價(jià)格昂貴的熒光顯微鏡才能觀察的問題。

注意事項(xiàng)（１）免疫熒光法最適宜進(jìn)行冰凍切片的染色，因?yàn)榇朔N切片一般抗原保存得較好。若是石蠟切片則應(yīng)首先選用免疫酶法等染色技術(shù)。（2）使用商品的熒光標(biāo)記抗體，在進(jìn)行染色前應(yīng)作抗體效價(jià)的測(cè)定，找出合適的稀釋度后再進(jìn)行成批染色。一般而言，在陽性物質(zhì)發(fā)出明亮熒光而背景又較暗時(shí)的稀釋度是較為合適的。高稀釋度的熒光抗體可以減少非特異性著色使染色結(jié)果更具特異性，但稀釋度過高會(huì)導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。低稀釋度的熒光抗體使結(jié)果較易觀察，但會(huì)帶來非特異性的著色，甚至出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。（3）非特異熒光的消除。非特異性熒光的消除方法較多。一般而言，冰凍切片的非特異性熒光較強(qiáng)，石蠟切片的非特異性熒光較弱。常用的方法有①先用非免疫血清如10％牛血清等處理切片，然后再行熒光染色。②用小鼠相應(yīng)組織的干粉吸收熒光抗體中的非特異性成分。③選擇合適的稀釋度和切片。④選用高特異性和高效價(jià)的熒光抗體。（4）洗滌要徹底。每道程序都有用蒸餾水或緩沖液洗滌以清除殘留在切片中的試劑，以達(dá)到特異著色的目的。洗滌時(shí)不論是沖洗還是振蕩洗滌，其基本原則是要達(dá)到洗滌干凈的目的，或者說充分稀釋上一道程序中的試劑，使其含量降至最低。一般只要有足夠的時(shí)間，以靜置延長每次洗滌時(shí)間為宜，這是防止脫片的較好辦法。洗滌液的PH值應(yīng)為7.2~7.4之間，過高過低的不利于染色過程，尤其是在偏堿的PH值條件下。（5）孵育時(shí)間與溫度。免疫熒光法一般孵育溫度在37℃，時(shí)間為20-30分鐘時(shí)是最佳時(shí)間與溫度。當(dāng)然，也與抗體的效價(jià)，組織抗原的含量與部位，切片的厚度等有關(guān)。二、免疫酶標(biāo)方法免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術(shù)。基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下六點(diǎn)：1、酶催化的底物必需是特異的，而且容易被顯示，即催化反應(yīng)所形成的產(chǎn)物易于在光鏡和電鏡下觀察。2、酶反應(yīng)的終產(chǎn)物所形成的沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，而影響組織學(xué)定位。3、較易獲得純的酶分子。4、中性PH值時(shí)，酶分子應(yīng)穩(wěn)定。5、在酶標(biāo)過程中，酶連接在抗體上，不能影響二者的活性。6、被檢組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似的物質(zhì)，否則結(jié)果將難以判定。

上述六點(diǎn)中以1．2兩點(diǎn)最為重要符合上述要求的，最為常用的酶是辣根過氧化物酶（Horseradish

Peroxidase，HRP）。其次是堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase，AKP），除此兩種外，還有葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase，GOD）等，但因其形成的不溶性色素?cái)U(kuò)散作用較大，在應(yīng)用上受到很大限制。HRP廣泛分布于植物界，因其辣根含量最高而得名。它是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結(jié)合組成的一種糖蛋白（糖占18％左右），分子量為40，000道爾頓，等電點(diǎn)3～9，最適PH為5.0左右。HRP易溶于水和58％以下的飽和硫酸銨溶液，其活性部分為鐵卟啉，稱輔基。酶的蛋白部分無活性。酶蛋白和鐵卟啉輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm；一般以O(shè)D403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(最高可達(dá)3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。對(duì)于純度低，質(zhì)量差的酶，需經(jīng)純化后才能使用。HRP的底物是H2O2，在分解過程中，與H2O2形成初級(jí)復(fù)合物，無電子供體存在時(shí)，反應(yīng)不再繼續(xù)進(jìn)行，當(dāng)電子供體存在時(shí)，反應(yīng)以一定的速度形成第二種復(fù)合物，繼之HRP催化H2O2所形成的中間型產(chǎn)物，迅速生成水，酶被還原，電子供氫體被氧化，聚合，再經(jīng)氧化環(huán)化，最后形成吲哚胺多聚體，于酶反應(yīng)部位，形成不溶性棕褐色沉淀，與組織對(duì)比清晰，達(dá)到定位、定性、定量的目的。AKP是一種磷酸酶的水解酶，磷酸單酯酶對(duì)于連接于作用物磷酸基上的醇基沒有特異性，因它可以水解多種有機(jī)磷酸酯，生成醇和磷酸鹽離子。該酶在許多人體組織或動(dòng)物組織中有分布，如肝、胎盤、白細(xì)胞、腎、小腸等。AKP的分子量為80KD，最適PH為9.8，其活性受底物及濃度、緩沖液及其離子濃度等因素影響，如用二乙醇胺緩沖液（1mol／L，PH9．8）對(duì)AICI’具有活化作用，酶的活性高，而用甘氨酸一NaOH緩沖液則對(duì)AKP有抑制作用。AKP的活化劑有鎂和錳離子，Mg++的適應(yīng)濃度為10mol/L。甘氨酸、檸檬酸鹽，EDTA等對(duì)AKP有抑制作用。AKP對(duì)溫度具有較高的敏感性，從25℃增加到35℃，其催化反應(yīng)速度增加1.5倍。當(dāng)選用不同的底物時(shí)，AKP可催化形成不同顏色的終產(chǎn)物。例如，萘酚一AS一MX和快藍(lán)（Fastblue，F(xiàn)h）為底物時(shí)生成藍(lán)色產(chǎn)物，可與HRP催化的產(chǎn)物形成鮮明的對(duì)比，用快紅（Fastred）代替快藍(lán)則生成紅色不溶性產(chǎn)物，而且內(nèi)源性AKP較易清除，可以較好地避免內(nèi)源性酶的干擾，使其具備了某些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)而日益?zhèn)涫苤匾?。免疫酶法與免疫熒光法大致相同，也可以分為以下幾種。1、直接法：簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)，非特異性背景反應(yīng)低。其缺點(diǎn)是，每種抗原必須分別用其抗體的酶標(biāo)記物，且敏感性較間接法低。2、間接法：用一種酶標(biāo)抗體就可與多種特異性一抗配合而檢查多種抗原，而且敏感性也優(yōu)于直接法。

3、酶橋法：酶橋法的建立是免疫酶法重大改進(jìn)的標(biāo)志。將用化學(xué)交聯(lián)法將酶與抗體分子結(jié)合的技術(shù)改進(jìn)為用酶和酶抗體免疫反應(yīng)而結(jié)合的方法，避免了由于化學(xué)反應(yīng)過程中對(duì)酶活性和抗體效價(jià)的不良影響。其基本原理是用酶免疫動(dòng)物，制備高效價(jià)、特異性強(qiáng)的抗酶抗體，然后用第二抗體作橋，將抗酶抗體和特異性的第一抗體（即連結(jié)在組織抗原上的抗體）連接起來，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)過酶催化底物的顯色反應(yīng)后，顯示出抗原所在的部位及含量。

作為橋的第二抗體（即橋抗）必須對(duì)特異性抗體（一抗）和酶抗體都具有特異性，這樣才能將二者相連起來，因此，一抗和酶抗體應(yīng)由同一種屬動(dòng)物產(chǎn)生。酶橋法較好地保護(hù)了抗體和酶的活性，但：①在抗酶抗體的抗血清中，含有低親和力和高親和力兩類抗體，它們作為抗原與抗體結(jié)合，主要依賴于橋抗體對(duì)它的親和力，而與其本身對(duì)酶的親和力無關(guān)，故兩者均可被連接在橋抗體上，由于低親和力的抗酶抗體與酶結(jié)合較弱，漂洗時(shí)易解離，使部分酶丟失，從而降低了方法的敏感性。②抗酶抗體血清中，亦含有非特異性抗體，其抗原性與抗酶抗體相同，所以能與橋抗體結(jié)合，但卻不能與酶結(jié)合，這樣影響了組織抗原的顯示。70年代初，Sternberg在各種標(biāo)記抗體法和酶橋法的基礎(chǔ)上，建立了PAP法，并加以改良，成為應(yīng)用最為廣泛的免疫組織化學(xué)技術(shù)之一。4、PAP法（過氧化物酶-抗過氧化物酶法）與酶橋法相似，都是借助橋抗體將酶連結(jié)在與組織抗原結(jié)合的第一抗體上，所不同的是：將酶和抗酶抗體制成復(fù)合物（PAP）以代替酶橋法中的抗酶抗體和隨后結(jié)合的酶，將兩個(gè)步驟合并為一個(gè)步驟。PAP復(fù)合物五角形環(huán)狀結(jié)構(gòu)，異常穩(wěn)定，沖洗時(shí)酶分子不會(huì)脫落，從而大大提高了敏感性，Petrali等報(bào)告，PAP法比酶橋法靈敏度高20倍。PAP法應(yīng)用廣泛，其主要優(yōu)點(diǎn)為：①最大限度地保存了抗體活性。因?yàn)樵谒械姆磻?yīng)過程中，任何抗體均未被酶標(biāo)記，避免了標(biāo)記過程中對(duì)抗體活性的損害。②靈敏度高。由于是多層抗原抗體反應(yīng)，由于免疫放大作用，使得結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的酶分子增多，并且PAP法復(fù)合物性質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這樣與酶底物反應(yīng)后的呈色反應(yīng)增強(qiáng)，使微量的或抗原性弱的抗原顯示出來，提高了靈敏度。③背景淡。PAP法中，連接抗體中即使存在著非特異性抗體，因其不是抗IgG的特異性抗體，故不能與抗HRP抗體相結(jié)合，也就不能把PAP復(fù)合物連接在非特異性抗體上。PAP法的不足之處是PAP的制備較為復(fù)雜。5、注意事項(xiàng)（1）免疫酶最適宜進(jìn)行石蠟切片的染色。對(duì)保存時(shí)間較久的石蠟標(biāo)本或在制作石蠟塊的過程中抗原成分丟失或被封閉的組織，酶的消化是非常重要的。

（2）除直接法，特別是酶橋法和雙PAP法，由于步驟較多，每步驟間的沖洗就顯得非常重要，常常是導(dǎo)致染色失敗或結(jié)果不理想的主要原因。

（3）各級(jí)抗體的稀釋度是染色成敗的關(guān)鍵。一般而言，特異性一抗的稀釋度應(yīng)盡可能高，橋抗體的濃度要足夠，酶標(biāo)抗體或抗酶抗體的稀釋度要適中。（4）用HRP作為標(biāo)記酶，要注意封閉內(nèi)源性的HRP的干擾，若封閉效果不理想，也可以將H2O2甲醇作用于切片的步驟移至特異性的抗體孵育之后進(jìn)行，或兩次封閉，即切片消化之后和加橋抗體之前。三、親和免疫組織化學(xué)技術(shù)親和免疫組織化學(xué)技術(shù)（affinityimmunhistoichemistry）是一種將親和細(xì)胞化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)合起來的技術(shù)。親和細(xì)胞化學(xué)（affinitycytochemistry）是一種利用兩種物質(zhì)之間高度親和能力而相互結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)。親和物質(zhì)往往是一些有雙價(jià)或多價(jià)結(jié)合能力的物質(zhì)，可與多種物質(zhì)結(jié)合而形成復(fù)合物，不但親和物質(zhì)之間有高度親和力，而且與可作為標(biāo)記物的熒光素、酶、同位素以及鐵蛋白、膠體金等結(jié)合，從而可利用顯微鏡來進(jìn)行觀察，這種親和反應(yīng)一方面不同于組織化學(xué)反應(yīng)中的分解、置換、氧化與還原，另一方面也不是抗原抗體的免疫反應(yīng)。因此，Bayer（1976）首次將之稱為親和組織化學(xué)。

1、卵蛋白和生物素免疫染色卵白素（Avidin），雞蛋白中含有的一種堿性蛋白質(zhì)，與生物素（又稱維生素H）以及其他物質(zhì)（例如熒光素和酶）具有很高的親和力。生物素（維生素H，Biotin）是Kogl等（1936）首先從雞蛋黃中分離出來的。以輔酶的形式參與各種羥化酶反應(yīng)。不論生物素還是卵白素均能與酶（過氧化物）結(jié)合并不影響酶的活性，這樣就將親和化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)合起來而形成卵白素-生物素免疫染色技術(shù)。親合組織化學(xué)技術(shù)引入免疫細(xì)胞化學(xué)后使其敏感性進(jìn)一步提高，更利于微量抗原（抗體）在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的檢測(cè)。目前已經(jīng)建立的方法（1）標(biāo)記卵白素-生物素（Labeledavidinbiotin,LAB）技術(shù)，是將活化的生物素（即利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾后的可制成各種基團(tuán)的衍生物）和免疫球蛋白等共價(jià)偶聯(lián)后，加入與熒光或過氧化物酶結(jié)合的卵白素，利用生物素和卵白素的親和結(jié)合，顯示生物素偶聯(lián)的物質(zhì)（即抗原）。（2）橋式卵白素---生物素（bridgedavidinbiotinBRAB）技術(shù)，是利用卵白素作為橋梁，連接生物素偶聯(lián)物質(zhì)和生物素化的過氧化酶，而顯示于生物素偶聯(lián)的物質(zhì)。上述兩種方法均須以生物素標(biāo)記第一抗體（即特異性抗體），應(yīng)用有一定的困難和局限。（3）卵白素—生物素---過氧化物酶復(fù)合物（Avidin-biotinperoxidasecomplex,ABC）技術(shù)2、ABC法

抗生物素蛋白（卵白素）-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法ABC法是Hsu等于1981年在BRAB法和LAB法的基礎(chǔ)上改良的。其特點(diǎn)是利用抗生物素分別連接生物素標(biāo)記的第2抗體和生物素標(biāo)記的酶。其第1抗體不為標(biāo)記物所標(biāo)記，生物素標(biāo)記的第2抗體與ABC復(fù)合物相連接。ABC復(fù)合物是將過氧化物酶結(jié)合在生物素上，再將生物素-過氧化物酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應(yīng)而制備的。ABC法的優(yōu)點(diǎn)是：敏感性強(qiáng)，特異性強(qiáng)，背景染色淡，方法簡(jiǎn)單，節(jié)約時(shí)間，并且由于生物素與抗生物素具有和多種示蹤物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重免疫染色。操作步驟1、4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中過夜。蠟塊制作。切片，貼片。0.01MKPBS清洗5min×3后；2、加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml+0.01MKPBS100ml+30%過氧化氫）30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，0.01MPBS清洗5min×3；3、加入配好的0.3%TritonX100（30%TritonX100+0.01MKPBS100ml）30min，以增加細(xì)胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；4、加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS100ml+疊氮納0.08g）稀釋的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗體，0.01MKPBS洗5min×3；5、加入0.01MKPBS稀釋的的二抗，室溫孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；6、加入ABC復(fù)合物之類的抗體，室溫孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸餾水迅速?zèng)_三次；7、加入顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，時(shí)間一般不超過30min，可不時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速?zèng)_三次后加入0.01MKPBS終止反應(yīng)；8、梯度酒精脫水之后，封片，拍照。3、SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法）該法由于用鏈霉親和素替代ABC法中的親和素—生物素復(fù)合物，因此背景清晰，敏感性增加，無非特異性染色，陽性反應(yīng)易于辨認(rèn)。在操作步驟中，與SABC法相比，僅有一個(gè)步驟不同，即試劑盒中的鏈霉菌抗生物素—過氧化物酶替代了親和素—生物素—過氧化物酶。SP法因?yàn)殪`敏度高、背景低等優(yōu)點(diǎn)，是目前免疫組化首選方法之一。操作步驟A脫蠟、梯度酒精脫水；B滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O2常溫下避光孵育10min，PBS沖洗3次×3min；C抗原修復(fù)：置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中用煮沸（微波爐可高火4次×6min），自然冷卻30min以上，至室溫后PBS沖洗3次×3min；D封閉：用封閉液（一般與二抗來源一致，如正常羊血清工作液）封閉，常溫下10~30min，傾去勿洗。E一抗孵育：滴加適宜濃度的一抗4℃冰箱孵育過夜（最常用），37℃復(fù)溫45min，PBS沖洗5次×3min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照）；F二抗孵育：滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30min,PBS沖洗5次×3min；GSP反應(yīng)：滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗5次×3min；HDAB顯色：配置DAB/H2O2反應(yīng)液孵育組織切片，鏡下控制染色，一般3~10min，自來水充分沖洗；I蘇木素復(fù)染：一般胞漿蛋白或胞膜蛋白可以適當(dāng)染至幾十秒~幾分鐘，但細(xì)胞核蛋白在幾秒。若過染，可以用1%HCl褪色；J常規(guī)脫水、透明、封片。四、免疫金銀法免疫金銀法（Immurogold-slivermethod,IGSM）或稱免疫金銀染色（Immurogold-sliverstaining,IGSS）是一種新的免疫組織化學(xué)技術(shù)，近年來又不斷改進(jìn)，已成為最為靈敏而又經(jīng)濟(jì)的方法之一。免疫金銀法實(shí)際上是在免疫金法的基礎(chǔ)之上發(fā)展形成。利用膠體金作為標(biāo)記物。膠體金系指金的水溶膠，溶膠是一種物質(zhì)以大或小的微小粒子分散在另一種物質(zhì)中所形成的體系，被分散的物質(zhì)叫分散相，容納分散相的物質(zhì)叫分散介質(zhì)。按分散相離子的大小可將分散體系分為三種，相分散體系（分散相粒子直徑大于10nm）；膠體分散體系（分散相粒子直徑在1~100nm之間）；低分子-離子分散體系（分散相粒子直徑〈1nm〉。膠體金屬于膠體分散體系，是指金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶膠。溶膠的顏色取決于分散相物質(zhì)的顏色，對(duì)同一種物質(zhì)的溶膠而言，粒子大小不同，顏色也不同。若粒子為20-40nm的金溶膠，因主要吸收波長為530nm的綠光而呈深紅色，60nm的金溶膠因主要吸收波長為600nm的橙黃色光而呈紫藍(lán)色。在光鏡水平應(yīng)用的膠體金粒直徑不能小于10nm，否則無可見的紅色。免疫金法是將用膠體金（直徑>20nm）標(biāo)記的間接抗體或A蛋白再與特異性抗體結(jié)合，在光鏡下就可見紅色的反應(yīng)物出現(xiàn)，不需進(jìn)行呈色反應(yīng)。但該法要求金標(biāo)抗體濃度高，因此，價(jià)格昂貴，既不經(jīng)濟(jì)同時(shí)也不夠敏感。免疫金銀染色（IGSS）是在免疫金染色的基礎(chǔ)上，在對(duì)苯二酚存在的情況下，通過含銀離子的顯影液中的還原反應(yīng)，使在抗原抗體反應(yīng)部位的金粒子周圍形成很多沉淀層，光鏡下就可看到陽性反應(yīng)部位呈清晰的棕黑色，從而顯示不易被光鏡定位的金粒，顯示出組織中抗原的部位。這種方法不僅提高靈敏度，同時(shí)金標(biāo)記抗體可以稀釋10倍以上后應(yīng)用，此外還可避免使用具有致癌危險(xiǎn)的有機(jī)色素。IGSS法的主要優(yōu)點(diǎn)是：（1）敏感性高。與其他的免疫組織化學(xué)技術(shù)相比，IGSS法被認(rèn)為是最敏感的方法，尤其適合于只含微量抗原的組織標(biāo)本。（2）應(yīng)用范圍廣。IGSS法不僅可以在冰凍切片，細(xì)胞涂片以及培養(yǎng)細(xì)胞、石蠟切片上進(jìn)行光鏡觀察，而且還能應(yīng)用于樹脂包埋的切片的電鏡觀察，并且能準(zhǔn)確定位抗原。（3）定位準(zhǔn)確。IGSS法的銀顆粒沉積在抗原抗體反應(yīng)部位，一般無擴(kuò)散，定位較為準(zhǔn)確。（4）方法簡(jiǎn)便、安全、成本低、經(jīng)濟(jì)、同時(shí)標(biāo)本也可以長期保存。（5）用醋酸銀代替硝酸銀和乳酸銀，不僅保持了原有方法的敏感性、特異性、低背景、對(duì)比度好的特點(diǎn)，而且整個(gè)顯影過程可以在常光下進(jìn)行，從而彌補(bǔ)了在暗室顯色的不足。

IGSS法的主要問題是非特異性背景，由于其非特異性背影染色影響了IGSS法在常規(guī)免疫組織化學(xué)鑒別診斷上的應(yīng)用。

復(fù)習(xí)題簡(jiǎn)述免疫組化技術(shù)的基本原理免疫組化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)免疫組化技術(shù)適合檢測(cè)組織細(xì)胞中的哪些成分？免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇第一抗體時(shí)要注意哪些？與普通石蠟切片制作技術(shù)相比，制作免疫組化切片時(shí)固定、脫水、透明、包埋等環(huán)節(jié)應(yīng)注意什么問題？為什么要進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)的方法有哪些？為防止脫片，常用的粘片劑有哪些？簡(jiǎn)述PAP法的原理。簡(jiǎn)述ABC法和SP法的實(shí)驗(yàn)原理和流程？第三節(jié)免疫組化過程中的注意事項(xiàng)一、制片過程（一）為達(dá)到免疫組織化學(xué)技術(shù)的要求，組織固定越新鮮越好。（二）組織脫水必須徹底干凈（三）、切片必須完整、均勻、平展、無皺折（四）切片的附貼必須牢固，必須使用合適的粘貼劑。（五）切片必須烘烤附貼牢固，既要經(jīng)得起抗原修復(fù)時(shí)高溫的作用而不使輕易脫片，又不至于破壞抗原。（六）切片脫蠟必須干凈，否則將會(huì)影響免疫組化染色的最后結(jié)果。二、緩沖液免疫組化染色標(biāo)記是對(duì)生物體組織抗原進(jìn)行標(biāo)記，抗原抗體最適合的pH值為7.2~7.6，最常用的是0.0lmol/LpH7.4磷酸緩沖液(PBS)。簡(jiǎn)易配法：5000ml蒸餾水中分別加入lgNaH2PO4、15.6gNa2HPO4、42.5gNaCl。但如果是采用堿性磷酸酶(AP)作為標(biāo)記物底物的方法時(shí)可以用0.02mol/LTBSpH8.2緩沖液比較好。三、注意抗原修復(fù)為什么進(jìn)行抗原修復(fù)抗原修復(fù)方法可分為化學(xué)方法和物理方法?；瘜W(xué)方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶常用的物理方法有單純加熱、微波處理和高壓加熱。HIER對(duì)大多數(shù)的抗體有益，尤其是對(duì)核抗原的修復(fù)作用更加明顯，最常用的抗原修復(fù)液是pH6.0的枸櫞酸緩沖液和pH8.0的EDTA緩沖液抗原修復(fù)，必須注意以下問題：1、PH值的應(yīng)用范圍及選擇。2、抗原修復(fù)時(shí)應(yīng)選擇最佳溫度。3、抗原修復(fù)時(shí)有效溫度所需持續(xù)時(shí)間根據(jù)各單位的設(shè)備條件以及使用的儀器不同，抗原修復(fù)時(shí)在有效的溫度范圍內(nèi)所持續(xù)的時(shí)間也不一樣。4、抗原修復(fù)液必須遵循自然降溫規(guī)律，否則效果不好或達(dá)不到抗原修復(fù)的目的。5、盡量使用足量的抗原修復(fù)液。6、切片必須附貼牢固。四、去除內(nèi)源酶及內(nèi)源性生物素，降低背景的染色1、去除內(nèi)源酶常用的去除內(nèi)源性酶的方法是3%過氧化氫水溶液。最好室溫10min。2、去除內(nèi)源性生物素采用生物素方法染色前也可以將組織切片進(jìn)行0.01%卵白素溶液室溫處理20min。3、滅活堿性磷酸酶最常用的方法是將左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值為7.6~8.2，能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶，對(duì)于仍能干擾染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。五、適當(dāng)合理地使用封閉試劑，減少背景產(chǎn)生的非特異性染色為了減少背景產(chǎn)生的非特異性染色，在免疫組化染色的過程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫動(dòng)物血清，以減少背景的染色一般常見實(shí)用的血清是2%~10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室溫下作用10~30min即可，但應(yīng)注意此種結(jié)合是不牢固結(jié)合，所以最好不要沖洗，傾去余液直接加一抗，對(duì)于多克隆抗體來講，易產(chǎn)生背景著色，在稀釋特異性抗體時(shí)可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。六、選擇合適的抗體1、按使用方便可分為兩種類型1）濃縮型抗體①可作為各種疾病檢測(cè)的常備抗體。②成本低，價(jià)格較便宜。③需要稀釋抗體，手續(xù)較為復(fù)雜。④需要配置各型號(hào)的微量加樣器，以利于量取精確的抗體量。⑤需要具備一定的英語水平2）即用型抗體。①使用方便。②對(duì)于不具備或基本不懂免疫組化技術(shù)的人，只要按照說明書的方法使用，也能獲得理想的結(jié)果。③不需要配置多種昂貴的微量加樣器。④特別適合于基層單位。⑤價(jià)格較濃縮型抗體貴。⑥即用型抗體不可作為常備貯存抗體。2、按的實(shí)際使用范圍，把抗體分為兩個(gè)類：1）適合于冰凍切片，涂片，細(xì)胞培養(yǎng)片。2）適合于石蠟切片，冰凍切片，涂片和細(xì)胞培養(yǎng)片。3、選擇合適的單克隆或多克隆抗體。多抗和單抗特性比較：（1）均一性。單抗是一種純度很高的均一抗體。多抗是多種種類和亞類Ig的混合物。（2）穩(wěn)定性。單抗的穩(wěn)定較差，而多抗的穩(wěn)定性則較好。（3）特異性。單抗特異性強(qiáng)，敏感性高，一般不發(fā)生交叉反應(yīng)。而多抗能與抗原上的多種抗原決定簇結(jié)合，所以特異性較差，較易引起交叉反應(yīng)。（4）重復(fù)性。單抗的重復(fù)性好，而多抗每批都不一樣。（5）沉淀反應(yīng)：多抗由于與抗原多價(jià)結(jié)合容易形成網(wǎng)絡(luò)樣沉淀，而單抗只與抗原結(jié)合產(chǎn)生二聚體，不能直接形成抗原抗體沉淀物。4、抗體的加入注意以下問題1）當(dāng)PBS沖洗完畢后，在加入抗體，如一抗，二抗或三抗，必須將存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能讓切片干涸2）加入的抗體以一滴為佳。3）切片沒擦好將會(huì)影響加入抗體的質(zhì)量，正確的做法就是徹底地用PBS沖洗，摔干切片擦干切片周邊的PBS，再滴入一滴抗體輕輕搖勻即可。5、抗體的保存抗體儲(chǔ)存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲(chǔ)存的抗體中蛋白濃度很低（10-100Mg/L），就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對(duì)抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。已稀釋的抗體應(yīng)存在4℃-8℃條件下抗體原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20℃條件下，并避免反復(fù)凍融。為防止細(xì)菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉?？贵w經(jīng)真空冷凍干燥后置-20℃以下可保存3-5年。七、選擇合適的孵育時(shí)間。孵育必須在濕盒內(nèi)進(jìn)行。第一抗體的孵育時(shí)間，有較多的使用范圍，應(yīng)用于臨床檢測(cè)抗體的孵育時(shí)間。一般室溫下孵育在30-60分鐘，120分鐘，對(duì)于研究性質(zhì)的抗體孵育時(shí)間，也可按照上述的時(shí)間，但也有人提出于4℃冰箱中過夜孵育，有人不主張于4℃冰箱中過夜八、連接抗體的選用必須正確，否則可造成假陰性的現(xiàn)象。第一抗體有單克和多克隆之分，連接抗體則要根據(jù)選用的抗體來進(jìn)行，例如：第一抗體選用的是單克隆鼠抗人**抗體，連接抗體也要選擇相應(yīng)的兔抗鼠IgG，這樣才能連接上九、復(fù)合物的使用及孵育時(shí)間的確定。各種方法有各自的復(fù)合物，如ABC法，復(fù)合物是卵白素和生物素結(jié)合的復(fù)合物，再帶有HRP，SP法，（LsAB法）的復(fù)合物是鏈霉菌素蛋白復(fù)合物，再帶有HRP。除此之外，根據(jù)水解底物的不同，可產(chǎn)生不同的顏色，例如：帶有HRP的酶，水解的底物一般為DAB產(chǎn)生黃棕色，帶AKP的酶，水解的底物一般為AEC產(chǎn)生紅色。

十、PBS的沖洗1、單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。

2、溫柔沖洗，防止切片的脫落。3、沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。

4、PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。十一、顯色免疫組化染色的顯色是最后的關(guān)鍵問題一般辣根過氧化物酶(HRP)的檢測(cè)系統(tǒng)選用DAB或AEC顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色。但要得到最佳的顯色效果，必須在鏡下嚴(yán)格控制，以檢出物達(dá)到最強(qiáng)顯色而背景無色為最終點(diǎn)如果是堿性磷酸酶(AP)最好選用NBT/BCIP作為顯色系統(tǒng)（結(jié)果染為藍(lán)黑色）。1、DAB顯色系統(tǒng)：二氨基聯(lián)苯胺（3,3′-Diaminobenzidine,DAB）是辣根過氧化物酶最敏感、最常用的顯色底物，反應(yīng)產(chǎn)物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被廣泛地用于蛋白印跡（WB)、免疫組織化學(xué)(IHC)和免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)、斑點(diǎn)印跡(Dotblot)和生物芯片(Biochip)等的染色和顯色反應(yīng)。二氨基聯(lián)苯胺染色試劑盒（DABStainingKit）為25倍（25X）濃縮液，采用特殊配方，靈敏度高，背景低，儲(chǔ)存穩(wěn)定，使用方便。保存條件：試劑盒應(yīng)在-20℃，避光、密封保存。注意事項(xiàng)：1）DAB溶液應(yīng)低溫密封保存。如有結(jié)晶析出，應(yīng)確保結(jié)晶完全溶解再行使用；

2）顯色工作液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，新鮮配制的工作液應(yīng)為無色或淺棕色，如顏色過深，請(qǐng)勿使用；

3）DAB在常溫下不穩(wěn)定，每次取用后均應(yīng)及時(shí)加蓋密封放回冰箱，以免因DAB分解影響實(shí)驗(yàn)，或因滲漏造成實(shí)驗(yàn)環(huán)境污染；

4）DAB有潛在致突變作用，操作時(shí)應(yīng)注意穿戴好防護(hù)用具。2、AEC顯色系統(tǒng)：AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）是辣根過氧化物酶（HRP）的生色底物。在過氧化物酶的催化下，電子供體AEC在過氧化氫氧化下，生成穩(wěn)定的紅色產(chǎn)物。該紅色產(chǎn)物不溶于水，但溶解于有機(jī)溶劑。適用于HRP系統(tǒng)的IHC和WesternBlot實(shí)驗(yàn)的酶促顯色。3、NBT/BCIP顯色系統(tǒng)：NBT/BCIP(NitroblueTetrazolium/5-Bromo-4-chloro-3-IndolylPhosphate)是一種用于Northern印跡實(shí)驗(yàn)、Southern印跡實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Westernblot)、原位雜交(Insituhybridization)、免疫組化實(shí)驗(yàn)過程的單組分溶液。該試劑是特別用于堿性磷酸酶系統(tǒng)的試劑。NBT/BCIP產(chǎn)生一種可溶于乙醇的紫色反應(yīng)產(chǎn)物。4、光鏡控制顯色方法（1）室內(nèi)操作：注意溫度與時(shí)間的關(guān)系，室溫最宜5分鐘。（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。十二、對(duì)照片的設(shè)置（1）空白對(duì)照（陰性對(duì)照）：第一抗體由PBS或非免疫血清取代。（2）陽性對(duì)照：用已知含有要檢測(cè)抗原的切片作陽性對(duì)照。（3）回收實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照：已知抗原與相應(yīng)的第一抗體混合，發(fā)生結(jié)合沉淀，再用此沉淀抗體復(fù)合物進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為陰性。（4）替代對(duì)照：用于第一抗體同種動(dòng)物的血清或無關(guān)抗體代替第一抗體結(jié)果為陰性。（5）自身對(duì)照：在同一切片上，應(yīng)將不同組織成分中的陽性或陰性結(jié)果與檢測(cè)的目的物對(duì)照比較。十三、對(duì)照組和染色結(jié)果的評(píng)價(jià)1、陽性染色特點(diǎn) ①Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。（非特異性～細(xì)胞與組織無區(qū)別）IHC中常見的抗原表達(dá)模式有以下幾種：a.細(xì)胞漿內(nèi)彌漫性分布，多數(shù)胞漿型抗體的反應(yīng)如此，如細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）和波形蛋白（vimentin）等；b.細(xì)胞核周的胞漿內(nèi)分布，其判別要點(diǎn)是細(xì)胞核的輪廓被勾畫得很清楚，如CD3多克隆抗體的染色；c.胞漿內(nèi)局限性點(diǎn)狀陽性，如CDl5抗體的染色；d.細(xì)胞膜線性陽性，大多數(shù)淋巴細(xì)胞標(biāo)記的染色如此，如CD20、CD45RO；e.細(xì)胞核陽性，如Ki-67及雌、孕激素受體蛋白ER、PR等。一種抗體可同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞漿和細(xì)胞膜的陽性表達(dá)，如EMA可呈膜性和胞漿內(nèi)彌漫性陽性反應(yīng)；CD30抗體②染色強(qiáng)度不同：顏色深淺不一（非特異性染色彌散性均勻）

2、組織切片制作過程的影響①固定不良—非特異性染色，顯示不均。②邊緣干燥—非特異性染色（常見），加抗體時(shí)勿干片。3、人工假象與特異性結(jié)果顯示不在同一平面上。陽性對(duì)照：用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。對(duì)照切片呈陽性結(jié)果，標(biāo)為陽性對(duì)照。陰性對(duì)照：用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對(duì)照。其實(shí)這只是陰性對(duì)照中的一種，陰性對(duì)照還應(yīng)包括空白、替代、吸收和抑制實(shí)驗(yàn)。一切的判定方法都是力求使免疫組化染色結(jié)果判斷更標(biāo)準(zhǔn)，但各單位采取的標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，所以判斷標(biāo)準(zhǔn)化問題還有待長期實(shí)踐中病理學(xué)術(shù)界商討判定標(biāo)準(zhǔn)。一是以檢測(cè)結(jié)果陽性細(xì)胞指數(shù)來定性(如核抗原的標(biāo)記)，判斷方法是以一個(gè)視野中的陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞的百分比，再取10個(gè)相同視野算取平均指數(shù)；另一種方法以染色陽性強(qiáng)度和陽性檢出率相結(jié)合而定，一般陽性細(xì)胞數(shù)在0~25為陰性，25~50為十，50~75為十十，75以上為十十十。此種判定方法容易出現(xiàn)人為誤差現(xiàn)象。有條件的實(shí)驗(yàn)室最好能用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)定量分析更為準(zhǔn)確。假陽性反應(yīng)可發(fā)生在：①抗體與非待檢抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，在使用多克隆抗體時(shí)易出現(xiàn)；②組織對(duì)抗體的非特異性吸附，特別是在有大片組織壞死或組織中有較多富于蛋白的液體時(shí)容易發(fā)生；③內(nèi)源性過氧化酶的作用，在脾臟、骨髓及一些炎性病變組織的染色中易出現(xiàn)；內(nèi)源性堿性磷酸酶的作用，特別是腸黏膜上皮和腎近曲小管的刷狀緣有高濃度的堿性磷酸酶，若處理不徹底，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；④判斷失誤，將腫瘤組織中殘留的正常組織的免疫組織化學(xué)陽性信號(hào)誤認(rèn)為是腫瘤的染色反應(yīng)；⑤當(dāng)腫瘤浸潤破壞正常組織時(shí)，使被破壞的正常細(xì)胞胞漿內(nèi)的可溶性蛋白釋放，后者被腫瘤細(xì)胞非特異吸附或吞噬，使瘤細(xì)胞出現(xiàn)該種抗原的陽性反應(yīng)；⑥外源性和內(nèi)源性色素的干擾。假陰性反應(yīng)可發(fā)生在：①組織內(nèi)待測(cè)抗原已被分解破壞，或抗原含量過低；②抗原被遮蓋，多由于醛類固定劑的使用，使組織中的大分子蛋白借醛鍵形成交聯(lián)而遮蓋待檢抗原；③抗體質(zhì)量不佳或稀釋度不當(dāng)；④技術(shù)操作失誤等。十四、免疫組化常見問題及其解決辦法1、一抗從4℃拿出后，為什么要進(jìn)行37度復(fù)溫？（1）一方面，防止切片從4℃直接放入PBS易脫片；（2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用，4℃和37℃時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。2、切片染色后背景太深，如何區(qū)分特異性與非特異性著色？（1）抗體濃度過高（2）抗體孵育時(shí)間過長或溫度較高（3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長（4）組織變干（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長（大于24小時(shí)）（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體3、脫片產(chǎn)生的原因有哪些？（1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。（2）組織切的不好，切片機(jī)的問題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。（3）沒烤好，時(shí)間短，溫度不夠之類。（4）操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。（5）修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過長了，或者放進(jìn)100℃的修復(fù)液時(shí)手法不好，咚的一聲就丟進(jìn)去了，這樣容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片。（6）一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹(jǐn)慎，用PBS的時(shí)候盡量用泡的，不要沖。4、免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么？（尤其是微波修復(fù)）5、DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？（1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。（2）有可能是顯色液底物加到片子上后沒有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后最好將片子來回左右晃動(dòng)幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。（3）如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。最外側(cè)的組織片最好離顯色液外緣0.5cm。6、所染的全部切片均為陰性結(jié)果，包括陽性對(duì)照在內(nèi)。全部（－）原因可能：①染色未完全嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行；②漏加一種抗體，或抗體失效；③緩沖液內(nèi)含疊氮化鈉，抑制了酶的活性；④底物中所加H2O2量少或失效；⑤復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)7、所有切片均呈陽性反應(yīng)，原因可能是：①切片在染色過程中抗體過濃，或干燥了。②緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準(zhǔn)確，洗滌不徹底。③使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應(yīng)時(shí)間過長。④抗體溫育的時(shí)間過長。⑤H2O2濃度過高，呈色速度過快。粘附劑太厚。8、所有切片背景過深，原因可能是：①未加酶消化處理切片。②切片或涂片過厚。③漂洗不夠。④底物呈色反應(yīng)過久。⑤蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血。⑥使用全血清抗體稀釋不夠。

9、陽性對(duì)照染色良好，檢測(cè)的陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)。最常見的原因是：標(biāo)本的固定和處理不當(dāng)。10、交叉反應(yīng)指抗體除與其相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)外還與其它抗原發(fā)生反應(yīng)。1）抗原特異性。2）共同決定簇。3）決定簇相似。十五、免疫組化雙染實(shí)驗(yàn)流程（一）脫蠟和水化（二）第一抗體的染色（三）第二抗體的染色