作文模版大查學(xué)校查重

Supervisor:Supervisor:Prof.ZhangFacultyofAnimalScience&GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,CommencementinMay, 英文縮 英文全 中文名

Marker-assistedselectionPolymorphicinformationcontenttativetraitRestrictedfragmentlengthpolymoephismSodiumdodecylsulfateSingleNucleotidePolymorphismsFolliclestimulatinghormonePolymerasechainreactionEthylenediaminetetraaceticacid,disodiumsaltStatisticalpackageforthesocialscienceGenerallinearmodelBasepairDeoxyribonucleicacidRibonucleicacidMillimolarconcentration

RevolutionsperminuteAgaroseGelElectrophoresisBonemorphogeneticproteinNationalBonemorphogeneticproteinSingleSinglestrandconformationAdisintegrinandAdisintegrinandmetalloproteasewithPhosphatePhosphateBuffered

Tris硼酸電泳緩沖液TE 性本次試驗(yàn)利用PCR-SSCP技術(shù)和直接 技術(shù)對(duì)影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的BMPR-IB和ADAMTS-1 產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行相關(guān)聯(lián)分析；運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)ADAMTS-1 組織進(jìn)行表達(dá)量分析，對(duì)于影響綿羊繁殖力的候 在轉(zhuǎn)BMPR-IB864試驗(yàn)羊品種出現(xiàn)三種AA、AB、BB，該846位點(diǎn)發(fā)生C>TAA型，而羊母羊和高山細(xì)毛羊母羊AB型頻率略高于AAA。小尾寒羊、高山細(xì)毛羊、湖羊三種綿羊χ2G2值均未達(dá)到顯著水平（P>0.05）,而羊的χ2值和G2值達(dá)到顯著水平（P<0.05），說(shuō)明除了Hardy-weinbergF在BMPR-IB95%PIC羊和高山細(xì)毛羊信息含量處于中度多態(tài)（0.25<PIC<0.5）。顯著性檢驗(yàn)分析表明：高山細(xì)毛羊與小尾寒羊、湖羊，羊與小尾寒羊、湖羊中差異呈現(xiàn)顯著（P<0.05）。BMPR-IB846位點(diǎn)突變?cè)诓煌敝沉δ秆蛉后wBMPR-IB3′511C>TCG型中，非編碼區(qū)544位點(diǎn)雜合C>G，發(fā)現(xiàn)三種型CC、CT、CG。在高山細(xì)毛羊母羊群體中，CT型對(duì)于產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響，而在其他兩個(gè)群體中不同型對(duì)于產(chǎn)羔數(shù)影響不顯著，而CT型對(duì)于高山細(xì)毛羊產(chǎn)羔ADAMTS-1根據(jù)綿羊8個(gè)組織進(jìn)行表達(dá)量分析可知所有群體 羊雙羔母羊的1.54倍、羊單羔母羊的2.61倍。通過(guò)對(duì)ADAMTS-1 碼區(qū)出現(xiàn)C1506T、G1509A，均屬于同義突變，三種帶型分別命名為AA、AB、ACχ2檢驗(yàn)表明Hardy-weinberg平衡狀態(tài)，PIC值屬于低度中度多態(tài)（0.25<PIC<0.5）。ADAMTS-1對(duì)于羊和小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)有重要的影響，初步認(rèn)定是羊和小尾寒羊的多胎主效。：Littersizeisthemostimportanteconomictraitsinsheep,butthelittersizetraitheritabilityislowthresholdtraits,thetraditionalmethodsimprovementprogresshasbeenslow.Atpresent,withtheemergenceofnewbiotechnology,especiallymolecularmarkertechnologyiswidelyusedintheinitialscreeningofsheep,greatlyimprovingtheefficiencyandaccuracyofselection.ThisexperimentusingPCR-SSCPanddirectsequencingofBMPR-IBgeneandADAMTS-1genegeneticpolymorphismysisoftheeffectoffecundityofsheep,Andysisoflittersizeinsheepwereassociatedwithbiologicalinformationysis,TheexpressionofADAMTS-1geneindifferenttissuesofsheepwasyzedbyreal-timefluorescent tativetechnique,andtheeffectofADAMTS-1geneonthetranscriptionlevelwasverified.Theresearchaimedtoprovidesomereferenceforimprovingthesheepfecundity.TheresultsareasysisofPolymorphismat864LocusofBMPR-IBGeneCDSRegionandItsRelationshipwithLitterSizeinSheepBreedsTheresultsshowedthattherewerethreekindsofgenotypeAA,ABandBBintestedsheepbreeds,andC→Tmutationoccurredincodingregionof846.AAwasthedominantgenotypeinSmallTailHanewesandHuewes,whileABwasthedominantgenotypeinMongoliaewesandGansualpinemerinoews.Awasthedominantallelesinallfoursheepsamples.Theχ2andG2valuesofSmallTailHanewes,GansualpinemerinoewesandHuewesdidnotreachedthesignificantlevel(p>0.05),buttheχ2andG2valuesofMongoliaewesreachedthesignificantlevel(P<0.05),whichindicatedthatthreeotherewesallfittedwithHardy-WeinbergequilibriumexceptMongoliaewes.TheobservedvalueFoffoursheepbreedsinBMPR-IBgenewereinthe95%confidenceinterval,andclosertotheon-line.AccordingtothePICamongdifferentbreedswecouldgetthatSmallTailHansheepandHusheepbelongtolowpolymorphism(PIC<0.25),whileMongoliasheepandGansualpinemerinosheepbelongtomoderatepolymorphism(0.25<PIC<0.5).SignificanttestshowedthatGansualpinemerinosheephadsignificantdifferenceswithSmallTailHansheepandHusheep,andMongoliasheephadsignificantdifferenceswiththeotherthreesheepbreeds(P<0.05).Themutationoccurredin846siteinBMPR-IBgenecodingregiondistributeddifferentlyinewegroupswithdifferentfecundity,whichmeantthatthislocuscouldbeconsideredasapotentialmolecularmarkerinsheep.ysisofPolymorphismatPartial3′UTRBMPR-IBGeneandItsRelationshipwithLitterSizeinSheepBreeds341sheepinthreesheepbreedstotal,usingpolymorphismdetectionin3sheep'partofthenonencodingregionwasamplified,511heterozygousC>TinCGgenotype,544heterozygousnonencodingregionofC>G,foundthreegenotypesofCC,CT,CG.InAlpineMerinoewesgroup,CTgenotypehasasignificanteffectonlittersize,anddifferentgenotypesintheothertwogroupsinthelittersizewasnotaffected,butthegenotypeofCTinsheeplambingmarkerneedsfurthervalidation.DifferentialExpressionofSheepADAMTS-1GeneinDifferentTissuesandysisofExon5PolymorphoismTheysisofexpression tyof8organsindicatedthattheexpressionofovaryinallgroupswassignificantlyhigherthanotherorgans,andtheexpressionleveloftherestorgansrankedfromhightolowwaskidney,heart,liver,lung,spleen,pituitary,andhypothalamus.TheexperimentshowedthattheovaryexpressionofADAMTS-1geneinSmallTailHanewes(multiple-births)was1.54and2.61timesofthatinMongoliaewes(twinbirths)andMongoliaewes(singlebirth)respectively.BasedontheADAMTS-1exon5geneysis,wefoundthatC1506TandG1509AappearedintheCDSregion,whichbothbelongedtothesynonymousmutation.ThreebandswerenamedasAA,ABandAC,andthesignificantysisindicatedthatthesethreegenotypeswerenotsignificantonlittersize.Theresultsofχ2fitnesstestshowedthatallsheeppopulationswereinHardy-weinbergequilibriumstate,andPICvaluebelongedtointermediateandmoderatepolymorphism(0.25<PIC<0.5).TheresultsofthisexperimentindicatedthatADAMTS-1geneyedanimportantroleonthelittersizeofMongoliaewesandSmallTailHanewes,whichwaspreliminarilyconsideredastheprolificacymajorgeneofthe1.1，于世界首位(FAOSTAT2013)。然而，我國(guó)現(xiàn)在綿羊產(chǎn)業(yè)存在許多棘手的問(wèn)題，，用品種引進(jìn)國(guó)內(nèi)用以改良我相關(guān)的分子標(biāo)記與候選MAS在繁殖育種的實(shí)際應(yīng)用上積累了豐富的素材。綿羊的繁殖性能是決定綿羊業(yè)生產(chǎn)效益的重要因來(lái)說(shuō)其繁殖力的高低直接影響生良。隨著分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，可以利用組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等新技術(shù)直接定位動(dòng)物重要的經(jīng)濟(jì)性狀分子標(biāo)記以及相關(guān)聯(lián)候選得到廣泛的應(yīng)用[2]。然而，絕大多數(shù)綿羊產(chǎn)單羔，數(shù)品種產(chǎn)雙羔或者多羔，因此，增BMPR-IBADAMTS-1多態(tài)性位點(diǎn)之間的關(guān)系，同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定ADAMTS-1在不同綿羊品種組織間差異表達(dá)量進(jìn)行分析，為揭 的多羔品種，例如我國(guó)的湖羊和小尾寒羊以及國(guó)外的Booroola羊[3]，上述品種 種多是一年一胎，且大多情況為產(chǎn)單羔。而南方的小尾寒羊和湖羊作為我然選擇而導(dǎo)致的，使與繁殖力相關(guān)的高產(chǎn)候選發(fā)生分離或者流向集中，最終率的措施是對(duì)配種前的母羊進(jìn)行短期優(yōu)飼。維生素的缺乏也會(huì)導(dǎo)致率的下降。母羊的產(chǎn)羔隨著羊，3-65-67歲種的遺傳多樣性，利用遺傳多樣性規(guī)律有利于DNA序列多態(tài)性，由于其數(shù)據(jù)不僅穩(wěn)定且信息量巨大，不受環(huán)境等外界因素干DNA標(biāo)記。蛋白質(zhì)（包括酶） ：在與否及在括兩類(lèi)蛋白的標(biāo)記和同工酶酶標(biāo)記法。利用同工酶在組中對(duì)應(yīng)座的具置，同工酶標(biāo)記可以劃分為：等位同工酶和復(fù)等位同工酶。：DNADNADNA分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)的方方面面[6-8]。根據(jù)技術(shù)的不同DNA標(biāo)記可以分為以下三類(lèi)[9-11]Southern雜交技術(shù)為分子標(biāo)記；第二代，以PCR技術(shù)為的分子標(biāo)記；第三代，是利RFLP限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）標(biāo)記法是利用限制性內(nèi)切酶（RE）把生物DNA icker等[12]于1974年建立的，RELP標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、等位 就可以標(biāo)記處大量的位點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)。RELP也存在著諸多不足例如DNA多態(tài)性探針的推廣[13]。但是后來(lái)隨著PCR技術(shù)的普及，在很大程度上彌補(bǔ)之前RELP技術(shù)中PCR-SSCP1984Noumi14]等對(duì)大腸桿菌野生型和突變型F1-ATPase利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SSCP）F1-ATPase在凝膠電變異的檢測(cè)提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支1989年，Orita等[15,16]人利用這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行多態(tài)性的檢測(cè)，并且SSCPPCR技術(shù)的普及和發(fā)展，Hoshino等[17]1992型，從此PCR-SSCP技術(shù)建立并且日趨純熟。PCR-SSCP是一種利用DNA或者RNA單鏈構(gòu)象具有多態(tài)性的特點(diǎn)，再結(jié)合上世紀(jì)80年代興起的PCR技術(shù)進(jìn)行 組DNA分子上某一特定的目的片段序列的特異性引物，利用PCR設(shè)備進(jìn)行目的片段特DNA雙鏈結(jié)構(gòu)變成單鏈構(gòu)象，變性后的兩條單鏈結(jié)構(gòu)因其堿基序列有一定的差構(gòu)象的差異導(dǎo)致不同的帶型遷移率有一定的差別。目的片段任意一條單鏈DNA PCR-SSCP方法具有適用于大樣本篩查且靈敏度較高和對(duì)DNA純度要求不 RAPD，RAPD最早由Wnliams和Welsh于1990年分別獨(dú)立發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)DNA多態(tài)檢測(cè)技術(shù)[20,21]。RAPD檢測(cè)DNA多態(tài)性的獨(dú)特方式很快滲透于 圖譜構(gòu)建、品種鑒定等遺傳和育種領(lǐng)域的方方面面[22]。RAPD基本原理是利用一系列隨機(jī)排列的寡聚核酸（8～10個(gè)堿基）為引物，再通過(guò)PCR對(duì)靶 ，PCR引物退火溫度低且允許一定的程序錯(cuò)配，RAPDDNA（4）RAPD技術(shù)成本低且引物通用性好，可以在不同物種間進(jìn)行檢測(cè)[24]RAPD技術(shù)的不足：（1）RAPDDNA模板濃度、Mg2+濃度、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差和穩(wěn)定性不高[25]；（2）RAPD分子標(biāo)記通?？梢宰R(shí)別顯性標(biāo)記，對(duì)于雜合位點(diǎn)識(shí)別能力較差[26]，使得該技術(shù)在定位或DNA片段，再者如果一個(gè)在同樣的位置出現(xiàn)所造成的，需要切膠回收產(chǎn)物經(jīng)后才能確定其序列的單一性。諸如此類(lèi)的不足對(duì)于檢測(cè)RAPD技術(shù)的應(yīng)用造成多方面的制約[27]。 1.41BMPR- 骨形態(tài)受體蛋白IB作為轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β亞基(TGF-Β)受體 。BMPR-IB在綿羊體內(nèi)垂體、 耳、骨骼、 、下丘腦、 等組織中都具有較高的表達(dá)，同時(shí)參與GDF-5(Growthdifferentiationfactor-5)、BMP-2(Bonemorphogeneticprotein-2)、BMP-4(Bonemorphogeneticprotein-4)、BMP-6(Bonemorphogeneticprotein-6)及BMP-15(Bonemorphogeneticprotein-15)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[28]。綿羊BMPR-1B序列CDS區(qū)域長(zhǎng)度為1509bp，編碼區(qū)共編碼502個(gè)氨基酸殘基，并被定位于綿羊第6號(hào) 的4q22-23區(qū)間。BMPR-IB 基酸序列高度保守，編碼一個(gè)TGF-β亞基，是調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的一類(lèi)多功能蛋白質(zhì)，并且存在多種細(xì)胞中。大量研究表明BMPR-IB ，新西蘭和法國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)Booroola綿羊BMPR-IB 碼區(qū)發(fā)生A>G突變使氨基酸 致使BMPR-IB蛋白受體部分失活，最終導(dǎo)致其功能無(wú)法正常進(jìn)行[29-31]。此次突變也被成為FecBBooroola綿羊擁有較高的繁殖力。在這一發(fā)現(xiàn)之后FecB在其他綿羊品種都有證實(shí)的Garole羊群[32]2003年，我國(guó)的湖羊與小尾寒羊上也被發(fā)現(xiàn)存在FecB突變[33]。楊華等的研究結(jié)果可知FecB突變同樣也出現(xiàn)美利奴羊，對(duì)于羊群的產(chǎn)羔數(shù)有顯著地影響[34]BMPR-IB則會(huì)導(dǎo)致小鼠不育，可能是因?yàn)槿笔托∈蟮穆亚饠U(kuò)展致使不能完成。對(duì)于BMPR-IB生理功能探究中，Mishina等[35]BMPR-IB的小鼠會(huì)出現(xiàn)生產(chǎn)不規(guī)律的周期和假孕現(xiàn)象，同時(shí)還觀察到細(xì)胞周?chē)念w粒細(xì)胞數(shù)目明顯少于野生型的小鼠-IB缺失突變導(dǎo)致小鼠顆粒細(xì)胞分泌芳香化酶能力顯著減弱，而在動(dòng)物合成雌激素過(guò)程中芳香化酶則起著重要的作用[36]2（cyclooxygenase鍵的作用，中此類(lèi)酶缺失是導(dǎo)致機(jī)體不孕的原因之一。畜的機(jī)制而發(fā)生。BMP-4、BMP-15、GDF-9和BMPR-IB對(duì)于綿羊分化的調(diào)控。BMPR-IB是影響動(dòng)物繁殖力的主效因子，對(duì)于深入研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白及受體 哺乳動(dòng)物的解聚蛋白樣金屬蛋白酶ADAMTS 均與ADAMTS-1有著緊密的聯(lián)系A(chǔ)DAMTS-1可以影響腫瘤 中都有ADAM 有跨膜結(jié)構(gòu)域并且存在I型TSP基序[42,43]。ADAMTS-1作為 26cDNA序列[44]ADAMTS-1可以分泌到細(xì)C-末端金屬蛋白酶亞結(jié)構(gòu)與ECM蛋白結(jié)合，降解蛋白聚糖、蛋白多糖和多功能蛋白聚糖[47]，ADAMTS-1ADAMTS-1可以與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子結(jié)合，進(jìn)而影響血管的生長(zhǎng)[48]。在心血管疾病研究中[49]例如動(dòng)脈硬化[50]心肌梗塞[8]腦血中[51]發(fā)現(xiàn)AATS1對(duì)上述疾病存在著一定的關(guān)聯(lián)ADAMT-1 對(duì)孕酮的合成有一定的影響并且可以合成孕酮，其 的表達(dá)與H/HCG的合成有很大的關(guān)系，與此同時(shí)在顆粒細(xì)胞的表達(dá)中直接影響囊狀 的生成ADMTS1在雌性動(dòng)物的卵丘細(xì)胞與 細(xì)胞中均有表達(dá)此 對(duì)于 細(xì)胞的能育有一定影響[52]ichrds等[47]以敲除ADAMTS-1 的小鼠為試驗(yàn)樣本，結(jié)果明被敲除ADAMTS-1 的雌鼠與對(duì)照組相比，敲除ADAMTS-1 的雌鼠 官畸形進(jìn)而表現(xiàn)為繁育能力低下其 壁變厚且存在許多旋繞； 內(nèi)出現(xiàn)大量的異常發(fā)育的包囊較對(duì)照組成熟 數(shù)量下降明顯，導(dǎo)致 不能，注射hG與PSG后仍不孕此類(lèi)現(xiàn)象只發(fā)生在雌鼠中，在公鼠并不影響其繁殖性能[53]?？芍狝DAMT-1基因在雌性動(dòng)物的調(diào)節(jié) 過(guò)程中起著重要的作用。近年來(lái)，在國(guó)內(nèi)鮑建軍等[54]以小尾寒羊、洼地綿羊、ADAMTS-1SNP位點(diǎn)與產(chǎn)羔性狀進(jìn)行分析研究；孫振梅等[55]和張瓊娣[56]等以黔北麻羊、黑和半細(xì)毛羊?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象構(gòu)DNA樣本池通過(guò)后續(xù)生物信息學(xué)分析可知，SNPs位點(diǎn)的突變對(duì)的RNAADAMTS-1可能會(huì)影響產(chǎn)羔性狀。熒光定量PCR技術(shù)是 PE公司于1995年研發(fā)成功的一種具有 Q-PCR的基本原理通過(guò)儀器收集整個(gè)PCR過(guò)程中發(fā)出的熒光信號(hào)來(lái)進(jìn)行實(shí) 的一類(lèi)技術(shù)，再利用每個(gè)樣品的Ct值對(duì)模板的相對(duì)定量或者利用標(biāo)準(zhǔn)曲對(duì)待測(cè)樣進(jìn)行總量分析上述所提及的Ct值是指PCR產(chǎn)物所發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度高于背景熒光信號(hào)強(qiáng)度時(shí)PCRCtQPCRPCRPCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，把已知Q-PCR可以得到不同Ct值可以繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中不知道樣品的濃度具體是多少可以利用熒光定量PCRCt到的Ct值帶入系統(tǒng)生成出標(biāo)準(zhǔn)曲線中用以計(jì)算未知濃度的樣品起始模板量[58,59]、Q-PCR定量分析法可分為兩類(lèi)分別是相對(duì)定量分析法和絕對(duì)定量分析法。 的mRNA表 、 fication, 內(nèi)參 是指一類(lèi)維持 基本機(jī)能在不同樣本中的拷貝數(shù)基本保持不變的一類(lèi)核酸序列常用的內(nèi)參 有βtinGHTSA28R1、18sA等。 反轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA合成率的差異等，如果不進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化處理得到的數(shù)據(jù)

可以校正同一批次實(shí)驗(yàn)中不同樣本數(shù)量和質(zhì)量之間的差異[60] ：

待測(cè)（待測(cè)樣本）待測(cè)（校正樣本2-△△CtReal-timePCR最為常見(jiàn)的一類(lèi)分析方法。此類(lèi)方法的特點(diǎn)是假定目的和內(nèi)參的擴(kuò)增效率都為100％（每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量），5％內(nèi)；整個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中保證穩(wěn)定不變。①用待測(cè)樣本（校準(zhǔn)樣本）內(nèi)參的Ct值歸一待測(cè)樣本（校準(zhǔn)樣本）的目的的Ct值ΔCt(sample)=Ct(target,sample)－Ct(reference,ΔCt(calibrator)=Ct(target,calibrator)－Ct(reference,②用校正樣本的ΔCt歸一待測(cè)樣本ΔCt)=2－△△t

experimentalgroup：實(shí)驗(yàn)組；controlgroup：對(duì)照組；Ct：目標(biāo) 第二章綿羊BMPR-IB CDS區(qū)864位點(diǎn)多態(tài)性及 均為2~3歲產(chǎn)羔胎次2~3胎的成年經(jīng) 血樣后肝素鈉抗凝，血樣于-20°C保存?zhèn)溆谩?TapDNA聚合酶、DL2000LadderMarker、DL750LadderMarker、Biowest 全式金生 烷基硫酸鈉（SDS）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）、Tris堿二水乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O）均購(gòu)自生工生物；試驗(yàn)所需引物由蘇州金唯智生物科技合成。100mlACD7:1用濃鹽酸將溶液pH8.0100mL高壓滅菌備用。1mL100mL。1g，1mol/LTris-HCl1mL100mL。氯仿：異戊醇（24:1）：24:1的比例混合后置于室1 血液，樣品中均加入ACD抗凝劑，冰 組DNA的提綿羊血 組DNA提取方法參照見(jiàn)附錄PCR本試驗(yàn)中所用引物均利用Olig6.0和Primer 根據(jù)已經(jīng)公布的綿羊BMPR-IB mRNA序列（GenBank登錄號(hào): .1），對(duì)BMPR-IB部分多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（P1）引物序列見(jiàn)表2-1。表2-1BMPR- Table2-1PolymorphismLociPrimerofBMPR-IB引

7外顯子(864位點(diǎn)模版的濃度、模版的質(zhì)量、退火溫度、鎂離子的濃度等都有可能影響PCR擴(kuò)增的效果。PCR反應(yīng)的優(yōu)化是為了獲得最佳擴(kuò)增效率的條件，而且還要盡可能的降低PCR反應(yīng)體系中的試劑的用量。PCR本試驗(yàn)中PCR25μL2-2PCRTable2-2PCRamplification試劑名 劑dd 10×PCRLoading Primer Taq 模板 共 PCR

2-3PCRTable2-2TheBestamplifiedreactionprogramofPCR6μLPCR1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，具2.2.3.1。1×TBE電泳緩沖液。7uL的變性劑，3uL的PCR目的產(chǎn)物，在PCR管中混勻?；靹蚝蟮臉悠贩湃隤CR99.9°C10min10min，10°C恒溫箱中，140V，18mA，3W，4 緩慢搖動(dòng)7min。再用蒸餾水漂2%氫氧化鈉顯影液(1min)，放入搖床直至條帶清晰為止。將膠片置于濕潤(rùn)的保鮮膜上，四面，包裝完畢后在燈下記2-4Table2-4FormulofPolyacrylamide試劑名 計(jì) 液 210總體 根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，人工判 型PCRPCRPopGene32軟件計(jì)算等位頻率、遺傳雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne）,以及對(duì)于群體內(nèi)型分布的Hardy-Weinberg檢驗(yàn)。對(duì)群體的多態(tài)PIC軟件檢測(cè)；對(duì)于后的結(jié)果利用MEGA（version5.0）軟件分析。采用SPSS19.0軟件分析綿羊產(chǎn)羔數(shù)與型之間的顯著性。 p(A)

2nAA2(nAAnAB

q(B)

2nBB2(nAAnAB A B nAB是該群體中AA、BB和 型的個(gè)數(shù) 哈代-溫伯格定律（Hardy-Weinberg平衡）是在一個(gè)隨機(jī)交配的大群體中，若沒(méi)有其他因素的影響，頻率和型頻率在世代交替過(guò)程中保持穩(wěn)定不Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)的群體，在一個(gè)座位具有兩個(gè)等位的情況下有以下： nAB′=(nAA+nAB+nBB)HnAA′=(nAA+nAB+nBB)PnAB′=(nAA+nAB+nBB)Q群體純合度（Ho）、雜合度(He)、有效等位數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)純合度通常表示的純合程度。而雜合度指的是等位雜合程度的一項(xiàng)指標(biāo)。一個(gè)群體中遺傳變異程度的大小，通常用每一個(gè)座上遺傳雜合度

HoHoi

HeHe1i中pi為某一特定位點(diǎn)上第i個(gè)等位 的頻率，n為某一特定 iNe i中，Ne為有效等 數(shù)，Pi為第i個(gè)有效等 頻率 在連鎖分析時(shí)，的多態(tài)性通常利用多態(tài)信息含量來(lái)表示，當(dāng)PIC>0.5時(shí)屬于高度多態(tài)，0.25<PIC<0.5屬于中度多態(tài)，PIC<0.25屬于低度多態(tài)。多態(tài)信息含量如下： m1PIC1P22P2Pi

i1j中，Pi和Pj分別表示第i個(gè)和第j個(gè)等位 將DNA 組樣品，用1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)(圖2-1)。條帶單一無(wú)雜帶，說(shuō)明DNA完整性較好，可以進(jìn)入下游試驗(yàn)。圖2-1綿羊血 組DNA檢Figure2-1GenomicDNAdetectionofsheep PCR bp符合預(yù)期。圖2-2綿羊BMPR- 引物P1PCR產(chǎn)Figure2-2P1PCRamplificationofBMPR-IBgenein對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，發(fā)現(xiàn)引物P1存在單核苷酸多態(tài)性，產(chǎn)生了A和B兩個(gè)等位 ，并且存在3種帶型，分別為AA、BB、AB(圖2-3)。圖2-3綿羊BMPR- SSCP檢Figure2-3SSCPdetectionofBMPR-IBgenein為了保證試驗(yàn)所得的可靠性，將AA、BB、AB帶型的樣品各取兩份送去測(cè) 發(fā)現(xiàn)1020位點(diǎn)(編碼區(qū)864)出現(xiàn)突變C>T序列比對(duì)及峰值(圖2-4、圖2-5)圖2-4綿羊BMPR- Figure2-4ThecomparisonofBMPR-IBgenecodingsequencesofinAA型(AABB型(BBAB型(AB圖2-5綿羊BMPR- AA型、AB型、BB 比Figure2-5SequencecomparisonofAA,ABandBBgenotypesofsheepBMPR-IB 對(duì)于四種綿羊品種(小尾寒羊多羔、湖羊多羔、羊單雙羔和高山細(xì)母羊的優(yōu)勢(shì)AA羊母羊和AB型AA型。四種綿羊的優(yōu)勢(shì)等位均為A。小尾寒羊、高山細(xì)毛χ2G2值均未達(dá)到顯著水平（p>0.05）,而羊的χ2值G2值達(dá)到顯著水平（P<0.05）。說(shuō)明除了羊其他三種羊均達(dá)到Hardy-weinbergFBMPR-IB95%多態(tài)的是小尾寒羊和湖羊（PIC<0.25），而在羊和高山細(xì)毛羊信息含量處于中度多態(tài)（0.25<PIC<0.5）(2-6)。利用SPSS21.0軟件對(duì)BMPR-IB的編碼區(qū)864位點(diǎn)的三種不同的 異性檢測(cè)(表2-7)。檢測(cè)所得可知在 、、、、、、、間高山細(xì)毛羊單羔和羊雙羔之間高山細(xì)毛羊單羔和湖羊多羔之間高山細(xì)毛羊雙羔和小尾寒羊多羔之間高山細(xì)毛羊雙羔和羊單羔之間高山細(xì)毛羊雙羔和湖羊多羔之間羊單羔和湖羊多羔之間、蒙古羊雙羔和湖羊多羔之間差異極顯著（P<0.01）。高山細(xì)毛羊雙羔和羊雙羔之間差異顯著（0.01<P<0.05）。而在高山細(xì)毛羊單羔和高山細(xì)毛羊雙羔之間羊單羔和羊雙羔之間、湖羊多羔和小尾寒羊多羔之間分布、、、、、、、 型間最小二乘積所得如下。AA型、AB型、BB型 小二乘積及標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.4703(1.2166)、1.7347(0.8357)、1.3846(0.5064)。TAAAB、BB7.243(P<0.0001)、3.199(0.0015)ABBB1.490(0.1377)。不同型與品種互作效應(yīng)的最小二乘積分析，3種型與四種綿羊有9種互做效應(yīng)(BB型高山細(xì)毛羊×AA(A×AA)1.3684、高山細(xì)毛羊×AB(A×AB)1.3770、高山細(xì)毛羊×BB(A×BB)1.3846 羊1.461 3.5333。不同型與品種之間互作效應(yīng)后多重比較(2-8)，A×ABA×AAA×BB與A×AAA×AB與A×BBA×AA與M×AAA×AA與M×AB之間、A×ABM×AA之間、A×AB與M×AB之間、A×BBM×AA之間、A×BBM×AB之間、H×AAH×AB之間差異不顯著（P>0.05），其表2- 型 頻Table2-5Genotypeandallele品

Genotype

等 頻AlleleSample AB 00SmallTailHanewes(multiple 00Mongoliaewes(single 00Mongoliaewes Gansualpinemerinoewes(single80.5505Gansualpinemerinoewes Huewes(multiple2-6Table2-6GeneticpolymorphismHardy-Weinbergequilibrium

Ewens-WattersonEwens-Wattersonneutrality品

χ2Probabilityof

G2Probabilityof

觀測(cè)FF

95%Confidenceinterval SmallTailSmallTailHanewes(multipleMongoliaewe(singleMongoliaewesGansualpinemerinoewes(single Huewes(multiple表2-7不 Table2-7Testofthedistributionofdifferentgenotypesinsixsheep

Gansualpinemerinoewes

SmallTailHanewes(multiple

Mongoliaewe(single

Mongoliaewes

Huewes(multiple 0.886 <0.000 Gansualpinemerinoewes(single <0.000 Gansualpinemerinoewes SmallTailHanewes(multiple Mongoliaewe(single Mongoliaewes注AA代表不顯著P>0.05,AB0.01<P<0.05,AC代表差異極顯著P<0.01。表內(nèi)代表PNote:AAreferstonosignificantdifference(P>0.05),ABreferstosignificantdifference(0.01<P<0.05),ACreferstoextremelysignificantdifference(P<0.01).ThedataintablerepresentP表2-8品種 Table2-8Testof ctionaleffectofbreedandgenotypeineweswithdifferentlaming品

1.290—1.414——0.783———————2.945——————————————————注：A×AA高山細(xì)毛羊×AA型A×AB高山細(xì)毛羊×AB型A×BB高山細(xì)毛羊×BB型S×AA小尾寒羊×AA型S×AB小尾寒羊×AB型;M×AA羊×AA型;M×AB羊×AB型;H×AA湖羊×AA型;H×AB湖羊×AB型Note:A×AAindicatesGansualpinemerinoewesandAAgenotype;A×ABindicatesGansualpinemerinoewesandABgenotypy;A×BBindicatesGansualpinemerinoewes×BBgenotypy;S×AAindicatesSmallTailHanewes×AAgenotypy;S×ABindicatesSmallTailHanewes×ABgenotypy;M×AAindicatesMongoliaewe×AAgenotypy;M×ABindicatesMongoliaewe×ABgenotypy;H×AAindicatesHuewes×AAgenotypy;H×ABindicatesHuewes×AB 在多種組織中都存在BP-B 的表達(dá)該 是調(diào)節(jié)和分化的重要蛋白受體。近年來(lái)，研究資料顯示，BMPR-B 對(duì)于 的調(diào)節(jié)主要在于抑制其分泌酮或控制 顆粒細(xì)胞的分化成熟，進(jìn)而間接影響動(dòng)物的繁殖[1]。FB突變是發(fā)生在綿羊BMR-B 編碼區(qū)746位()突變，從而導(dǎo)致攜帶該突變的 數(shù)增加，研究推測(cè)該突變可能導(dǎo)致 對(duì)激素的敏感程度提高也有研究表明該突變導(dǎo)致激素的分泌水平提高[63]。但是由于其配體的多樣、通路復(fù)雜和功能多樣性導(dǎo)致對(duì) 調(diào)節(jié)機(jī)制的過(guò)程并不明確而且目前研究中對(duì)于綿羊編碼區(qū)中的同義突變 較少。本試驗(yàn)通過(guò)利用直接 法和PSSP技術(shù)，對(duì) 高山細(xì)毛羊單雙羔、 羊單雙羔、小尾寒羊多羔和湖羊多羔的BMR-B編碼區(qū)864位T突變進(jìn)行關(guān)聯(lián)的分析，發(fā)現(xiàn)456只綿羊中，都存在A 型和AB 型而在 高山細(xì)毛羊中發(fā)現(xiàn)有BB型所得數(shù)據(jù)與hu等[64]試驗(yàn)所得結(jié)果不同，未在小尾寒羊體中發(fā)現(xiàn)B型，這可能是由于綿羊生存的環(huán)境和氣候所導(dǎo)致也可能是其B 型頻率在小尾寒羊品種中過(guò)低未檢測(cè)到在四種綿羊群體中優(yōu)勢(shì)等位 均是而 頻率中小尾寒羊和湖羊的優(yōu)勢(shì) 均為在 羊和 高山細(xì)毛羊中發(fā)現(xiàn)B的頻率高于。根據(jù)各品種間的IC多態(tài)信息含量可知，屬于低度多態(tài)的是小尾寒羊和湖羊(PI0.2)，而在 羊和 高山細(xì)毛羊信息含量處于中度多態(tài)(0.25PI0.5)，說(shuō)明該位點(diǎn)可作為連鎖分析的標(biāo)記位點(diǎn)，對(duì)提高選育高產(chǎn)羔率的綿羊有一定的價(jià)值。G2和χ2適合性檢測(cè)明，小尾寒羊母羊、高山細(xì)毛羊母羊湖羊母羊rdywinbeg處于平衡狀態(tài)說(shuō)明三個(gè)品種分別都適應(yīng)各自的環(huán)境并且沒(méi)有 工選育所影響但是 羊種并沒(méi)有處于rdyinbeg一現(xiàn)象可能與選育的 有直接關(guān)系且受自然選擇和人工選育影響較大。 與微效基因相要的意義。有資料顯示，BMPR-IB，主效 [65]。在中等繁殖力的綿羊品種中并存在R突變，本次試驗(yàn)就四個(gè)綿羊品種共計(jì)456只在BMP-IB編區(qū)864位發(fā)現(xiàn)T突變并且存在三種 型該點(diǎn)突變屬于同義突變并沒(méi)有引起氨基酸的變化且不同 型在四種綿羊品種中分布差異不同 高山細(xì)毛羊與小尾寒羊湖羊間差異極顯著P0.01)； 羊與小尾寒羊、湖羊間差異極顯著(P0.0)；甘肅高山細(xì)毛羊和 羊之間的差異也存在顯著性(0.01P0.0)但在高繁殖力綿羊品種湖羊與小尾寒羊中差異并不明顯(P0.0)。利用品種和產(chǎn)羔數(shù)互作后與基因型做對(duì)比發(fā)現(xiàn)品種間的的差異較大而品種間的分布并不明顯造成以上差異原因如下，編碼區(qū)864位雖然屬于同義突變，但是突變后 子由A變?yōu)镚，成為稀有 子，導(dǎo)致蛋白翻譯速度減慢，并且構(gòu)象產(chǎn)生一定的差異，在特定情況下導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的分化和 細(xì)胞的發(fā)育[66]因此可確定編碼區(qū)864突變可作為控制綿羊繁殖性狀的分析標(biāo)記位點(diǎn)。，456BMPR-864C>T突變，發(fā)現(xiàn)三種型AA、AB、BB。其中只有在高山細(xì)毛羊中發(fā)現(xiàn)BB型，而其他群體均只有兩種型AA、BMPR-IB在不同繁殖力綿羊品種間差異明顯，其是否是可以作為綿羊產(chǎn)羔第三章綿羊BMPR-IB 部分3端非編碼區(qū)多態(tài)性2.2.12.2.2DNA的提取2.2.3綿羊血液樣品的檢測(cè)本試驗(yàn)中所用引物均利用Olig6.0和Primer 3根據(jù)已經(jīng)公布的綿羊BMPR-IB mRNA序列（GenBank登錄號(hào): .1），對(duì)BMPR-IB部分多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（P2）引物序列見(jiàn)表3-1。表3-1BMPR- Table3-1PolymorphismLociPrimerofBMPR-IB引 退火溫

3′430bpPCRPCR同第二章 PCR P2引物擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰無(wú)雜帶（3-1），大小分別150bp符合預(yù)期大小圖3-1綿羊BMPR- 引物P2PCR產(chǎn)Figure3-1P2PCRamplificationofBMPR-IBgeneinSSCPP2A和B兩個(gè)等 ，并且存在3種帶型，分別為CC、CT、CG(圖3-2)圖3-2綿羊BMPR- SSCP檢Figure3-2SSCPdetectionofBMPR-IBgenein為了保證試驗(yàn)所得的可靠性，將CC、CT、CG帶型的樣品各取兩份送去測(cè) 型CC、CT、CG進(jìn)行分析，在CT型 3端非編碼區(qū)第511位點(diǎn)雜合C>T，在CG型 中，非編碼區(qū)544位點(diǎn)雜合C>G（3-4）CC型(CCCT型(CTCG型(CG圖3-4綿羊BMPR- CC型、CT型、CG 比Figure3-4SequencecomparisonofCC,CTandCGgenotypesofsheepBMPR-IB 共計(jì)341樣本SSCP分析所得如下(表3-2)。三種綿羊的優(yōu)勢(shì)等位 均為C。甘 羊單胎綿羊χ2值和G2值均未達(dá)到顯著水平（P>0.05）, 高山細(xì)毛羊單胎、小尾寒羊多胎的母羊χ2值和G2值達(dá)到顯 群體Hardy-weinberg平衡狀態(tài)。三種綿羊的觀測(cè)值F在BMPR-IB 95%置信區(qū)間內(nèi)，且接近于上線。根據(jù)各品種間的PIC多態(tài)信息含量可知，屬于態(tài)（PIC>0.5）(表3-3)。SPSS21.0BMPR—IB3′430bp580bp極顯著（P<0.01）高山細(xì)毛羊單羔與小尾寒羊多羔之間差異顯著。（0.01<P<0.05）。其余組之間差異不顯著（P>0.05）。表3- 型 頻Table3-2Genotypeandallele品

等 頻樣本量/只SamplenotypeleleyCTGSmallTailHanewes(multiple9Mongoliaewes(single0.Mongoliaewes0.Gansualpinemerinoewes(single5Gansualpinemerinoewes993-3Table3-3Geneticpolymorphism品

Hardy-Weinbergequilibrium

Ewens-WattersonEwens-Wattersonneutrality

χ2概 G2概 觀測(cè) 95%置信區(qū)Probabilityof Probabilityof F 95%ConfidenceSmallTailHanewes(multipleMongoliaewe(singleMongoliaewes Gansualpinemerinoewes(single Gansualpinemerinoewes表3-4不 Table3-4Testofthedistributionofdifferentgenotypesinfivesheep

Gansualpinemerinoewes

SmallTailHanewes(multiple

Mongoliaewe(single

Mongoliaewes Gansualpinemerinoewes(single Gansualpinemerinoewes SmallTailHanewes(multiplebirth) Mongoliaewe(singlebirth)注AA代表不顯著P>0.05,AB0.01<P<0.05,AC代表差異極顯著P<0.01。表內(nèi)代表PNote:AAreferstonosignificantdifference(P>0.05),ABreferstosignificantdifference(0.01<P<0.05),ACreferstoextremelysignificantdifference(P<0.01).ThedataintablerepresentP3.4.7BMPR- 型間最小二乘積所得如下。CC型、CT型、CG型 最小二乘積及標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.63(0.689)、1.96(0.723)、1.50(0.675)。兩兩進(jìn)行獨(dú)立T檢驗(yàn)比較可知CT型和CC、CG差異極顯著3.512(0.0005)、4.328(<0.0001)。而CC型與CG型差異不顯著1.456(0.1470)。不 型與三種綿羊有種互做效應(yīng)(表3-5) 高山細(xì)毛羊×CC(A×CC)1.49 高山細(xì)毛、×CT(A×CT)1.64、 羊、、、 型與品、、之間互作效應(yīng)后多重比較(4)，A×CCA×CT之間、A×CCM×CC之間、A×CCM×CT之間、A×AAM×CG之間、A×CTM×CC之間、A×CT與M×CT之間、A×CTM×CG之間、A×CTM×CC之間、S×CC與S×CT之間、S×CCS×CG之間、S×CTS×CG之間、M×CCM×CG之間、M×CCM×CT之間、M×CTM×CG之間差異不顯著（P>0.05），A×CCA×CG之間、A×CG與M×CC之間、A×CGM×CG之間差異顯著（0.05<P<0.01），表3-5品種 Table3-5Testof ctionaleffectofbreedandgenotypeineweswithdifferentlaming品種 ———14.537(<0.0001 —————7.063(<0.0001)AC—————— 0.218(0.8280)———————A×CC高山細(xì)毛羊×CC型;A×CT高山細(xì)毛羊×CT型;A×CG高山細(xì)毛羊×CG型;S×CC小尾寒羊×CC型;S×CT小尾寒羊×CT型;S×CG小尾寒羊×CG型;羊×CC型;M×CT湖羊×CT型; 羊×CGNote:A×CCindicatesGansualpinemerinoewesandCCgenotype;A×CTindicatesGansualpinemerinoewesandCTgenotypy;A×CGindicatesGansualpinemerinoewes×CGgenotypy;S×CCindicatesSmallTailHanewes×CCgenotypy;S×CTindicatesSmallTailHanewes×CTgenotypy;S×CGindicatesSmallTailHanewes×CGgenotypy;M×CCindicatesMongoliaewe×CCgenotypy;M×CTindicatesMongoliaewe×CTgenotypy;M×CGindicatesMongoliaewe×CGgenotypy3′端非編碼序列在轉(zhuǎn)錄后的加工過(guò)程中起著調(diào)控的作用，其中mRNA的穩(wěn)定性及翻譯效率等一系列生理進(jìn)程的調(diào)節(jié)，國(guó)內(nèi)外目前關(guān)于BMPR-IB的非編碼序列鮮有涉及[67,68][69]BMPR-IB。，、部分3′非編碼區(qū)序列進(jìn)行直接 和PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)高繁殖力和低繁殖力 的5′端，也就是說(shuō)5′包含了真核生物順式作用元件，而認(rèn)為3′端非編碼區(qū)序列對(duì)于mRNA的轉(zhuǎn)錄后 的3′端非編碼區(qū)包含大量的堿基有著豐富的遺傳信息[70]。3′端非編碼區(qū)涉及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，以及動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源的miRNA主要來(lái)源抑制靶序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物的合成[71]國(guó)外學(xué)者對(duì)于3′端非編碼區(qū) 驗(yàn)利用PCR-SSCP方法對(duì)3個(gè)綿羊品種3′端非編碼區(qū)511位點(diǎn)和544位點(diǎn)兩個(gè)位置的點(diǎn)突變進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)分析。結(jié)果表明，3個(gè)綿羊品種共計(jì)341個(gè)樣本中，存在3種 型，CC型、CT型和CG型，在3′非編碼序列第511位點(diǎn)和544位點(diǎn)發(fā)生了C>T突變和C>G的突變，第430bp到580bp擴(kuò)增后三種 羊單羔和 羊單羔之間、高山細(xì)毛羊單羔和 羊雙羔之間差異極顯著。，、； ； 型間最小二乘積所得結(jié)果如下：CC型、CT型、CG型 的最小二乘積及標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.63(0.689)、1.96(0.723)、1.50(0.675)。兩兩進(jìn)行獨(dú)立T檢驗(yàn)比較可知CT型和CCCG差異極顯著3.512(0.0005)4.328(<0.0001)。而CC型與CG型差異不顯著1.456(0.1470)。由于試驗(yàn)有局限性，得出的結(jié)果僅3413′部分非編碼CC、CT、CG三種型。在高山細(xì)毛羊母羊群體中，CT型對(duì)于產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響，而在其他兩個(gè)群體中不同型對(duì)于產(chǎn)羔數(shù)影響不顯著，而CT型對(duì)于高山細(xì)毛羊產(chǎn)羔第四章綿羊ADAMTS-1 試驗(yàn)所需的羊由省永昌縣養(yǎng)殖示范戶提供，小尾寒羊由隴西縣菜子鎮(zhèn)母羊養(yǎng)殖農(nóng)民專(zhuān)業(yè)合作社提供，頸靜脈ACD抗凝管-20°C保存；另外分別期的羊單羔母羊(4只)、羊雙羔母羊(4只)和小尾寒羊多羔母(4只)的、垂體、下丘腦、心臟、脾臟、肺臟、肝臟、總RNA提取試劑盒、TapDNA聚合酶及、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DNAMaker均購(gòu)自Takara寶生物公司(大連) 1 組DNA的提同第二章2.2.2綿 組DNA的提RNA總RNA提取按照，按試劑盒（寶生物）DNARNA2.2.3.14.2.3.2同第二章2.2.3.2反轉(zhuǎn)錄操作按照RTreagentKitwithgDNAEraser先在 的PCR管中加入成分體積將以上組分混勻，42℃2min成 體積 Reactionsolutionfrom 37℃15min，85℃5sec終止反應(yīng)。cDNA20℃?zhèn)溆没蛄⒓碢CR參照GENEBANK中綿羊ADAMTS- 登錄號(hào)：GU437212)cDNA全列，使用Primer5.0設(shè)計(jì) 引物。以β-actin(NM_ 4-1Table4-1primerAccessionPrimerProductLengthADAMTS- ADAMTS- β-PCR本試驗(yàn)中PCR25μL4-2PCRTable4-2PCRamplification試劑名 劑dd 10×PCRLoading Primer Taq 模板 共 PCR

4-3PCR4.2.6PCRPCR鎂離子的濃度等。PCR反應(yīng)的優(yōu)化是為了獲得最佳擴(kuò)增效率的條件，而且還要盡可能的降低PCRTable4-3TheBestamplifiedreactionprogramof4.2.74.2.7480ⅡSYBRGreenⅠQ-PCRQ-20μl2μl1:9cDNA模板(<100ng)4μl、SYBRRPremixExTaqTMⅡ反轉(zhuǎn)錄酶(10μM)10μl(TaKaRa,Dalian,hina)和7.2μlddH2OADAMTS-ADAMTS-β-二聚體，以及PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。Q-PCR反應(yīng)條件為：95°C，25s，60°C(ADAMTS-1)/60°C(β-actin)，30s；72°C，30s，40個(gè)循環(huán)，95°C，5s；65°C，60s；4°C，30s。PCR 表達(dá)量通過(guò)2-△△Ct[76]ADAMTS-1表達(dá)量，平為P<0.05，所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=10)表示。 、RT-PCR技術(shù)對(duì)羊單羔母羊羊雙羔母羊和小尾寒羊多羔母羊心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、下丘腦、垂體、8ADAMTS-1基因mRNAADAMTS-1在這幾個(gè)組織中均表達(dá)(4-1)。、 在8種組織的RT-PCR電Figure4-1RT-PCRelectrophoresispatternofADAMTS-1genein8organsof注: ;2心臟;3肝臟;4肺臟;5脾臟;6下丘腦;7垂體;8腎Note:1ovary;2heart;3kidney;4lung;5spleen;6hypothalamus;7pituitary;8利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)綿羊ADAMTS- 在三個(gè)綿羊群體8個(gè)組PCRADAMTS-18組織中表達(dá)量進(jìn)行分析，內(nèi)參B-actin和目的ADAMTS-1溶解曲線(圖4-2)，可知兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值均一，溶解曲線上呈現(xiàn)明顯的單峰，說(shuō)明Q-PCR反應(yīng)過(guò)程中，兩種引物擴(kuò)增特異性效果良好，沒(méi)有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增AB圖4-2綿羊ADAMTS- 和B- Figure4-2MeltingcurveforsheepADAMTS-1geneandB-actinAMTS1織（P0.5）,其余組織由高往低表達(dá)水平依次是腎臟、心臟、肝臟、肺臟、脾臟、垂體、下丘腦(圖43)。同一組織不同綿羊表達(dá)水平分析可知，中小尾寒羊多羔母羊與羊單羔母羊、羊雙羔母羊表達(dá)量差異顯著P.羊雙羔母羊和羊單羔母羊差異顯著（P<0.05），且小尾寒羊多羔的表達(dá)量是羊雙羔母羊的1.54倍、羊單羔母羊的2.61倍。其余組織間差A(yù)B圖4-3綿羊ADAMTS- Figure4-3TheexpressionlevelofADAMTS-1geneindifferentorgansofthreekindsof注:A中不同小寫(xiě)字母表示同一組織在不同綿羊群體下的表達(dá)量差異顯著(p<0.05,mean±S.E.);B中不同大寫(xiě)字母表示同一綿羊群體下不同組織中的表達(dá)量差異顯著(p<0.05,N=10,mean±S.E.)Note:DifferentlowercaselettersinAindicatesthattheexpressionofthesameorganwassignificantlydifferent(p<0.05,N=10,S.E.+mean)indifferentsheeppopulations;DifferentcapitallettersinBindicatesthattheexpressionlevelsofdifferentorgansinthesamesheeppopulationweresignificantlydifferent(p<0.05,N=10,mean+S.E.) 2％4)4-4ADAMTS-1Figure4-4ThePCRdetectionofsheepADAMTS-1geneexonSSCPP1存在單核苷酸多態(tài)性，產(chǎn)生了A、BC三個(gè)等位，并且存在3AA、AB、AC(4-5)圖4-5綿羊ADAMTS- 第五外顯子SSCP檢Figure4-5SSCPdetectionofsheepADAMTS-1geneexonAAAB和AC帶型的樣品各取兩份送去測(cè)1506C>T，1509G>A。序列比對(duì)及峰值(4-6)。AAAA型(AAAB型(ABAC型(AC4-6ADAMTS-第五外顯子AA型、AB型、ACFigure4-6SequencecomparisonofAA,ABandACgenotypesofsheepADAMTS-1geneexon對(duì)于三個(gè)綿羊群體(羊單雙羔)115SSCPAA均為A三個(gè)綿羊群體χ2值均未達(dá)到顯著水平（P>0.05）說(shuō)明三個(gè)綿羊群體達(dá)到息含量處于中度多態(tài)（0.25<PIC<0.5）(4-5)。表4- Table4-4Genotypeandallele

Sample

型

Genotype

等 頻A