蛋白質(zhì)的裂解

關于蛋白質(zhì)的裂解第1頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

用Edman降解法測多肽鏈的氨基酸順序，一次只能連續(xù)降解數(shù)十個殘基，用手工方法最多測二十多個殘基。然而，自然界蛋白質(zhì)的分子量通常在一萬以上，因此在測多肽鏈順序時，需將它們先裂解成一系列小肽，分別測出它們的順序，然后再找出它們的接頭位置，才能定出該肽鏈的順序。所以如何選擇肽鏈裂解的切點，將對順序測定起著重要作用裂解條件要求：

裂解點少專一性強反應產(chǎn)率高

裂解方法：酶法化學法

酶解和化學裂解是順序分析中互為補充缺一不可的手段一、引言早期：部分酸水解法裂解，由于專一性低，裂解后生成很多小肽，造成分離純化困難，工作量也很大。中期：生化學家改用蛋白酶酶解，因?qū)Ｒ恍詮?，故被廣泛地使用。后來：隨著自動順序儀的廣泛使用和對大肽段的需求，發(fā)現(xiàn)某些化學試劑對蛋白質(zhì)的裂解有特異的優(yōu)點?；瘜W法再流行。第2頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三（－）簡述用特異性水解酶裂解肽鏈有許多優(yōu)點：專一性強，降解后的肽段容易純化，產(chǎn)率較高，副反應少，在酸水解中容易受破壞的谷氨酰氨、天冬酰氨和色氨酸等在酶解中都不受影響。整個酶解反應中，酶解條件的選擇相當重要，需要考慮下列因素：（1）合適的pH（2）適宜的反應溫度（3）恰當?shù)拿概c底物的比率（4）選擇相應的反應時間

二、蛋白質(zhì)的酶裂解第3頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三第4頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

最常用的水解蛋白酶，專一性強,只斷裂賴氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽鍵，用它裂解蛋白質(zhì)常常可得到合適的肽段

商品胰蛋白酶中，常含有少量胰凝乳蛋白酶，這樣，在酶解時會產(chǎn)生不希望有的肽片段。因此，使用前需用L-1（對-甲苯磺酰）苯丙氨酰氯甲酮（簡稱TPCK）處理胰蛋白酶，以抑制胰凝乳蛋白酶的活力。也可直接訂購用TPCK處理過的胰蛋白酶。

1、胰蛋白酶第5頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

討論：

如果蛋白質(zhì)分子量較大，或遇到堿性蛋白含有較多的賴氨酸和精氨酸殘基時，則酶解后的肽段數(shù)就會很多，將給順序測定帶來很大麻煩。

方法：用檸康酸酐可逆保護賴氨酸的ε-氨基，使胰蛋白酶酶解時不會在賴氨酸羧端裂解，而只在精氨酸的羧端裂解，以后也很容易去掉保護基團。ε-氨基保護劑第6頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三第7頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

凝凝乳蛋白酶的前體是胰凝乳蛋白酶原，由245個氨基酸組成的單鏈，有5個二硫鍵。酶原本身沒有水解活力，靠胰蛋白酶激活，在Arg15---Ile16

肽鍵處水解，形成л-

胰凝乳蛋白酶。而л-胰凝乳蛋白酶又反過來對本身起作用，酶解掉二個二肽Ser14-Arg15

和Thr147-Asn148，生成具完全活力的a-胰凝乳蛋白酶。因此a一胰凝乳蛋白酶由A、B、C三條多肽鏈組成，它們分別含有13，130，96個氨基酸殘基。

2、胰凝乳蛋白酶第8頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

凝凝乳蛋白酶的專一性不如胰蛋白酶，酶解Tyr，Phe、Trp、Len等疏水氨基酸羧基所形成的肽鏈，也能在val、Ile、Ser、Gly的羧端裂解，但較慢。如果被裂解的鄰近基團是堿性的（如Lys、Arg或His），裂解能力將增加。倘若鄰近是Pro或Phe—Pro，則不能酶解。在酶解中，增加酶的比例（對底物）能提高酶解能力，這時，甚至象Ala-val鍵也能酶解。凝凝乳蛋白酶第9頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

專一性與胰凝乳蛋白酶類似適宜酶解pH值是2在順序測定中很有價值，因為在確定二硫鍵的位置時，在這樣的酸性環(huán)境下二硫鍵比較穩(wěn)定，很少有二硫鍵的互換反應。反應條件選擇恰當，可以變低特異性為高特異性。

在pH2.5的水溶液中，用胃蛋白酶酶解胰島素于3℃冰水浴恒溫反應1.5h，此后用lNNaOH調(diào)pH=9以終止反應。結果用ScphadexG-50柱（3.0×110cm）分離得到了很純的去B鏈羧端五肽胰島素，說明胃蛋白酶在酶解中只降解胰島素B鏈中第25位苯丙氨酸的羧基所形成的肽鍵（—Phc25--THR26-Thr27-Pro28－LyS29-aLA30）3．胃蛋白酶第10頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

含金屬的酶，鋅原子和鈣原子，鋅是活力所必需的，鈣使酶在高溫下穩(wěn)定，該酶易被EDTA所抑制。專一性比上面三種酶都差，用來直接酶解蛋白質(zhì)不太合適，因為產(chǎn)生的肽段相對較多，不僅純化起來麻煩，而且對以后的順序重排也不利。如用它來裂解次級肽，即先用專一性較強的酶或化學試劑把蛋白質(zhì)多肽鏈降解成大肽段，再切成小肽段時，嗜熱菌蛋白酶可發(fā)揮很好的作用。

胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶有一個共同的特點，即它們的作用范為比較寬，并且主要裂解中性氨基酸殘基。4.嗜熱菌蛋白酶第11頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三（三）幾種高特異性的肽鏈內(nèi)切酶

在蛋白質(zhì)順序測定中，對較大分子量的蛋白質(zhì)采用逐級特異性裂解是比較理想的。第12頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

Glu蛋白酶

Glu蛋白酶亦稱金黃色葡萄球菌蛋白酶，是從金黃色葡萄球菌菌株V8中分離得到的，是最有效、應用最廣泛的一個酶，分子量只有12,000。當酶解在磷酸緩沖液（pH7.8）中進行時，它能在谷氨酸和天冬氨酸殘基的羧端處裂解肽鍵。用碳酸氫銨（pH7.8）或醋酸胺（pH4.0）時，則僅在谷氨酸的羧端處裂解。該酶對下列蛋白質(zhì)只在谷氨酸的羧端處裂解：核糖體蛋白S7，L23，EL12，維生素A1結合蛋白,鈣結合蛋白，a1[lll］膠原蛋白,?2小球蛋白。第13頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

Arg蛋白酶（1）Chostripain酶

專一性裂解精氨酸羧端的蛋白酶。專一性很高；肽鏈的羧端是精氨酸；該酶在6mol／l尿素20小時內(nèi)仍保持活力，這樣對不溶性蛋白質(zhì)的長時間裂解就很有效。（2）凝血酶（thrombin）是另一個作用精氨酸羧端的特異酶,對Arg-Gly鍵裂解特別快。(3)頜下腺蛋白酶也有裂解精氨酸所形成的肽鍵的專一性,對磷脂酰膽堿交換蛋白只裂解Arg-Glu鍵，對血纖維蛋白原只裂解Arg-Arg鍵。第14頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

Lys蛋白酶選擇性一般不如Arg蛋白酶專一1）密環(huán)菌（Armillariamellea）是裂解賴氨酸氨端肽鍵,條件是在賴氨酸殘基的羧端必須聯(lián)有谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺殘基。這個酶對精氨酸也具有活力，如在酶解天冬氨酸氨轉(zhuǎn)移酶時，發(fā)現(xiàn)它在部分賴氨酸殘基氨端裂解外，還同時裂解三個Arg-Leu（Ile）鍵2）血纖維蛋白酶裂解血纖維蛋白原時也發(fā)現(xiàn)除裂解部分的賴氨酸外，也裂解精氨酸氨端肽鍵3)MyxobactcrAI-1是另一種Lys蛋白酶。它是從一種粘細菌中提取的，也能在賴氨酸殘基的氨端裂解，條件是，賴氨酸殘基的羧端通常聯(lián)有Tyr，Ala和Gln殘基4)凝血酶樣酶（thrombinenzyme)

是Lys-Leu鍵的高特異性Lys蛋白酶。第15頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

Pro蛋白酶特異性在Pro羧基所形成肽鍵處裂解的蛋白酶，從小羊腎中提取第16頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三（四）實驗方法1.胰蛋白酶裂解

（l）TPCK一胰蛋白酶降解稱1.0mg蛋白質(zhì)+0.5ml雙蒸水+0.5m10.2mol／lN-甲基嗎啉緩沖液（pH8.1）

+10-20ugTPCK-胰蛋白酶37℃保溫反應4-6h冷凍干燥加50ul雙蒸水溶解，離心上清液待分離純化后供測順序用第17頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三胰蛋白酶（200mg）溶于62m10.001mo1／lCaCl2用3%NaOH調(diào)pH至7.0

在15-20℃加人含6mgTPCK0.6ml無水甲醇溶液繼續(xù)攪拌維持pH7.0約5.5h用pH3.0的鹽酸水溶液透析2.5天然后凍干。

（2）TPCK處理胰蛋白酶分離純化第18頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三（3）TPCK一胰蛋白酶活力的測定方法

稱底物芐酰L-精氨酰乙酶鹽酸鹽（Bcnzyl-L-Argininccthv1cster·HC1簡稱BAEE)3.9mg溶于10ml0.05mol／lTris緩沖液（pH＝9.24）中，將TPCK處理過的胰蛋白酶

lmg溶于10m10.001NHCI中，吸底物3ml在紫外分光光度計上（波長253nm處），調(diào)節(jié)光密度為0，然后加人0.2ml酶液。每隔30秒鐘讀一次光密度數(shù)，直至讀數(shù)不變?yōu)橹?，一般?0分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

活力單位計算公式：a.u.=-------------O.D.C酶第19頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三（4）保護Lysε-NH2的方法

①檸康?；ǎ旱鞍踪|(zhì)溶于6mol／l鹽酸胍或8mol／l尿素（20-30mg蛋白質(zhì)／ml）在室溫（20℃）下用12NNa○H調(diào)pH至8.0檸康酸酐25mg（10倍于蛋白質(zhì)的量）激烈攪拌2小時，pH8.5左右透析或用SephadcxG-25柱除試劑和鹽

分離純化第20頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三②ETPA法：以ETPA與溶菌酶反應為例蛋白質(zhì)硼酸緩沖液（0.2mol/lpH=8.8）12mg蛋白質(zhì)/ml，過量的ETPA（按參與反應的Lys基團數(shù)計算）12倍，攪拌下分批滴加用lNNaOHpH=8.5－9.0加入ETPA時，產(chǎn)生沉淀2小時反應結束4℃透析(pH=8,5％(w/v)NH4HCO3)分離純化第21頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三③馬來酰化法：稱蛋白質(zhì)(200mg)溶于10ml的0.lmol／l磷酸鈉緩沖液冰浴冷卻滴加300mg馬來酸酐（溶于3ml無水三氧六環(huán)）用0.1N或0.5NNa○HpH=9.00℃下放置30min繼續(xù)攪拌1h室溫透析48h（外透液為2N氨水,pH8)冷凍干燥分離純化第22頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三2.胰凝乳蛋白酶裂解:酶解條件及緩沖液與胰蛋白酶相同,pH8.1，37℃，酶:底物=1:100，酶解1-4h3.嗜熱菌蛋白酶裂解:

緩沖液與胰蛋白酶相同pH8.1，50-55℃酶:底物=1:100或1:150，酶解2h

以避免胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的副反應第23頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三4．胃蛋白酶裂解:

1.0mg蛋白質(zhì)+0.5ml0.05N醋酸或稀甲酸中,pH2.0+10ug胃蛋白酶（溶于10ul雙蒸水）37℃下攪拌反應2h

冰凍干燥隨后溶于50ml雙蒸水中離心分離純化第24頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三5.Gul蛋白酶裂解:

蛋白質(zhì)1.0mg溶于1.0m1醋酸銨緩沖液0.1mol,pH4.0

加20ugGlu蛋白酶（溶于20ul雙蒸水）攪拌酶:底物=1:5037℃下保溫24-28小時冰凍干燥加50ul雙蒸水溶解

分離純化第25頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三6.Arg白酶裂解:

蛋白質(zhì)1.0mg溶于1.0ml雙蒸水加8.0ugArg蛋白酶（溶于20ul雙蒸水）37℃下攪拌反應1-4小時冰凍干燥再溶于50ul雙蒸水待分離純化

分離純化第26頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三7.密環(huán)菌蛋白酶裂解:

蛋白質(zhì)1.0mg溶于0.5m10.1mol/l1N-甲基嗎啉醋酸緩沖液或0.07％氨水（pH8.1）1ug酶溶于5ul雙蒸水（酶:底物=1:1000）37℃下攪拌反應4-6h冷凍干燥50ul雙蒸水溶解分離純化供測順序用第27頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三三、蛋白質(zhì)的化學裂解

是蛋白質(zhì)順序測定中的另一重要手段產(chǎn)物的肽段一般都比較大裂解產(chǎn)物適合于在自動順序儀中測定順序產(chǎn)物有利于肽段的吻合

因此化學法對較大分子量的蛋白質(zhì)順序測定是重要的缺點：因為化學裂解后的肽段較大。往往會遇到不溶解和集聚等問題，分離較困難，產(chǎn)率一般也比酶解為低。第28頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三第29頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三1．原理

。溴化氰（CNBr）裂解法是多種化學法中最重要的也是最常見的方法。

。由Gross和Witkop于1962年建立的。后人進行了系統(tǒng)研究,能專一裂解蛋氨酸殘基的羧端，產(chǎn)率達到85%

。由于蛋白質(zhì)中的Met一般都比較少，因此裂解后的肽段較少，新生成的肽段往往是大肽段，這樣很適合于自動順序儀測定，更適用于固相法測定。與胰蛋白酶裂解法配合起來，通常很容易獲得肽段的排列順序（－）溴化氰裂解第30頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三CNBr裂解蛋氨酸殘基的反應機理：

CNBr裂解肽鏈的甲硫氨酸羧基所形成肽鏈的反應第31頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三在酸性條件下氨基質(zhì)子化，可以避免一些副反應

如：用70％甲酸可以破壞肽鏈的卷曲，使甲硫氨酸側鏈暴露，有利于CNBr的裂解甲硫氨酸的氧化產(chǎn)物亞砜Met(SO)或砜Met(SO3)不能與CNBr反應為防止甲硫氨酸被氧化，整個反應應在氮氣流或充氮容器中進行當甲硫氨酸在N末端，則產(chǎn)生游離的高絲氨酸內(nèi)酯：第32頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三當肽鏈中有二個相鄰的甲硫氨酸，則產(chǎn)生一游離高絲氨酸內(nèi)酯和二個新肽段：當甲硫氨酸在C末端，則C末端變?yōu)楦呓z氨酸內(nèi)酯：第33頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

2.實驗方法蛋白質(zhì)70%甲酸中（5-50mg蛋白／ml70％甲酸）加30-100倍過量CNBr通N2充分混合后室溫（20℃）黑暗處放置24h加10倍量雙蒸水稀釋冰凍干燥或用70％三氟醋酸代替甲酸，25℃反應12h，然后用雙蒸水稀釋到5%三氟醋酸以終止反應分離純化第34頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三注意，如樣品溶解度差，可

3．討論

當甲硫氨酸在N末端時，反應常不完全，約有10％Met鍵保留下來，不被裂解，其原因是由于O-乙酰基取代了N一乙?；５?5頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三（二）羥胺裂解1．原理

NH2OH能專一地裂解–Asn-Gly-之間的肽鍵，其反應機理是：通過NH2OH作用先形成一個琥珀酸亞胺環(huán)狀物，最后導致–Asn-Gly-鍵的裂解，反應式如下：CONH2

CH2OH--HN-CH-CO-NH-CH2-CO-第36頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三例如：用NH2OH裂解DNA依賴的RNA聚合酶的?-亞基，裂解后用SephadexG－100柱分離得到二個肽段，一段是N端肽1–208殘基，另一段是C端肽209-329殘基。

如沒有這一步裂解，中間這段順序?qū)⒑茈y測定第37頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三

2．實驗方法蛋白質(zhì)(1-5mg/ml)2mol/l羥胺溶液（含6mol/l胍），45℃保溫LiOH4.5mol/l調(diào)節(jié)pH到9.0放置4-5h9％甲酸將pH調(diào)至2-3以終止反應。用SephadexG-25或Bia-GelP-2脫鹽在SephadexG-75柱上純化。第38頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三3．討論發(fā)現(xiàn)，當在pH2.5用NH2○H裂解Asp-Pro鍵時產(chǎn)率能達到80％。根據(jù)統(tǒng)計，每841個殘基中Asp-Pro鍵出現(xiàn)的幾率為1-2，實際上常達到3-4。用鹽酸羥胺裂解Asn-G1y的產(chǎn)率一般為50-80％。在降解反應中，即使有其它副反應，也是很低的，通常不會對混合肽段的純化產(chǎn)生影響。在蛋白質(zhì)氨基酸順序中，Asn-Gly鍵出現(xiàn)的幾率是很低的，平均每150個肽鍵也不一定出現(xiàn)一次。所以用這個方法降解產(chǎn)生的片段肽都很大，它對分子量大的蛋白質(zhì)的測定是十分有用的。第39頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三1.原理蛋白質(zhì)順序測定中，在色氨酸位點裂解也是常用的方法。1970年以前，裂解色氨酸的主要試劑是N－溴代琥珀酰亞按（簡稱NBS）或類似的強氧化劑。產(chǎn)生副反應較多，在裂解中，除色氨酸外，鄰近的組氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸也同時受到裂解。后來改用BNPS－Skatole，其對色氨酸裂解的專一性比NBS的高，產(chǎn)率通常在50-70％，缺點是試劑不太穩(wěn)定。裂解反應通常在醋酸溶液中進行，若用高質(zhì)量的新鮮試劑，副反應僅僅表現(xiàn)為對Met的氧化，并使半胱氨酸氧化成胱氨酸。

（三）色氨酸位點的裂解第40頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三用醋酸/12鹽酸/二甲基亞砜（DMSO）混合物，再加48%的溴化氫與蛋白質(zhì)反應更具有專一性，并能限制甲硫氨酸和半胱氨酸的側鏈氧化。反應過程是先由DMSO與鹽酸作用形成Me2S+Cl，Me2S+Cl反過來再氧化色氨酸中的吲哚環(huán)，再與DMSO/HBr作用形成溴化物，然后再裂解。第41頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三第42頁，講稿共47頁，2023年5月2日，星期三2．實驗方法細胞色素C（17mg）

冰醋酸（600ul）、12NHCl（300ul）和DMSO（25ul）室溫溶解加苯酚200mg30分鐘加HBr48%（100ul