實驗十三流式細胞技術檢測腫瘤治療藥物誘導的細胞凋

實驗十三流式細胞技術檢測腫瘤治療藥物誘導的細胞凋亡指導教師：唐穎1.實驗目的了解細胞凋亡、及流式細胞技術原理等基本知識。學習細胞凋亡的形態(tài)學觀察和流式細胞術檢測的方法。學習流式細胞技術標本的制作方法，了解流式細胞儀的使用。2.實驗原理2.1細胞凋亡的基礎知識2.2流式細胞技術的一般原理及應用2.3用流式細胞術檢測細胞凋亡的原理2.1細胞凋亡的基本知識：定義：細胞凋亡是細胞在一定程序控制下的自主死亡過程。細胞凋亡同細胞分裂、細胞分化一樣是機體生存和發(fā)育離不開的最基本的生物現(xiàn)象，通過凋亡可以平衡機體內細胞的數(shù)目，清除衰老、過剩、有害的細胞。細胞凋亡異常會引起免疫性疾病或腫瘤等。

（一）、細胞壞死是細胞受到急性強力傷害時立即出現(xiàn)的反應。早期表現(xiàn)為細胞膜破壞，線粒體腫脹。繼而溶酶體破裂,細胞內容物流出,引起炎癥。細胞凋亡與壞死的區(qū)別細胞凋亡與壞死的區(qū)別（二）細胞凋亡cellapoptosis

Kerr（1972）最先提出，與細胞壞死的區(qū)別是：①細胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體；②凋亡小體內有結構完整的細胞器；③不引起炎癥；④線粒體無變化，溶酶體活性不增加；⑤內切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖譜呈梯狀；⑥凋亡通常是生理性變化，而細胞壞死是病理性變化。細胞凋亡與壞死的區(qū)別胸腺細胞正常凋亡形態(tài)學檢測流式細胞法檢測DNALadder檢測熒光法檢測凋亡鑒定方法2.2流式細胞技術的一般原理及應用

流式細胞術(flowcytometry)是以流式細胞儀(flowcytometer，F(xiàn)CM)為工具，在液流系統(tǒng)中對懸液中的單個細胞、細胞器或生物粒子的生物、物理和化學特性進行快速測量并自動分析，并根據(jù)這些特性將所需要的細胞或細胞器從群體中加以分類收集的高技術。它的主要特點是，可以在單細胞水平上對大量細胞進行快速、準確、多參數(shù)的定量分析及分選，借此判斷細胞的體積、DNA含量、蛋白質含量、酶活性、細胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)，并可在無菌狀態(tài)下，對活細胞進行分類收集，收集的純度可達99％。

流式細胞儀工作原理

流式細胞儀（FlowCytometer）集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。散射光信號FALS

SensorLaser散射光信號RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter） 細胞相對大小及其表面積側向角散射光（SSC,SideScatter） 細胞顆粒度及細胞內細胞器的相對復雜性外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）流式細胞儀的檢測信號熒光信號使用熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光信號雙色直接染色數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)存儲:LISTMODE數(shù)據(jù)顯示: 直方圖(Histogram) 二維點圖(DotPlot) 等高線圖(ContourPlot) 密度圖(Density) 三維圖（3DPlot）等數(shù)據(jù)分析直方圖分析數(shù)據(jù)分析點圖分析數(shù)據(jù)分析等高圖和密度圖分析2.3用流式細胞術檢測細胞凋亡的原理利用流式細胞儀測定細胞光散射可對凋亡細胞進行分析。凋亡早期細胞因體積減小，胞漿及染色質固縮，F(xiàn)SC變小，SSC增大，凋亡晚期細胞FSC、SSC均變小，壞死細胞則因細胞膜通透性改變，細胞腫脹，F(xiàn)SC、SSC變大，胞膜破裂，胞內含物釋出后FSC、SSC均變小。用流式細胞儀也可以根據(jù)DNA含量不同，從細胞群體中鑒別凋亡細胞。凋亡細胞在G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，即凋亡峰（Ap峰）。通過此峰下的面積值可得出凋亡細胞在所測細胞群中所占的比率（用凋亡軟件定量）。另外，細胞凋亡受基因調控，有賴于某些蛋白質的合成，用流式細胞儀可同時測定凋亡細胞的FSC/SSC及DNA/蛋白質，進行多參數(shù)分析以研究不同的凋亡誘導作用機制。3.實驗材料、用品實驗材料：培養(yǎng)的Hela細胞實驗用品：①儀器與用具C02培養(yǎng)箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡和離心機等。微量加樣器(1μl-1ml)，0.5ml和1.5ml的Eppendorf管，20μl、200μl和1ml吸頭，10ml培養(yǎng)瓶，載玻片，蓋玻片等。②試劑放射線菌素D（誘導細胞凋亡的腫瘤治療藥物，如喜樹堿、紫杉醇、中藥砒霜等）；熒光探針：用PBS(pH7.4)將PI配成500μg/ml的貯液，在-20℃凍存。FACSCalibur,BDBioscience4.實驗步驟Hela細胞的傳代培養(yǎng)誘導細胞凋亡：向對數(shù)生長期細胞中加入放射線菌素D（可結合科研采用其他誘導細胞凋亡的腫瘤治療藥物）分別為0.25、0.5、1、2、4mg/L,作用6小時。用胰酶消化以上五個樣本以及對照的細胞，吹打收集于離心管中，1000r/min下離心8分鐘，倒去上清。加約1mlPBS重懸細胞，用注射器迅速注入到4ml4℃的70%的酒精中，固定8小時以上。去上清，用PBS4ml重懸細胞，再1000r/min下離心8分鐘，去上清控干液體后加0.3mlPBS，加入RNA酶A至終濃度為50ug/ml，37℃孵育30分鐘。將樣品插到冰浴中，停止酶的作用。待冷卻后加入50ug/ml的PI1.5ml,放于冰上在冰箱中染色至少30分鐘。3個小時之內在流式細胞儀上檢測樣品。5.實驗結果正常凋亡化療前后胃癌活檢標本中Caspase-3+細胞化療前(3.49%)化療后(94.86%)26KeylabofMedicineSchoolofSuZhouUniversity細胞凋亡——PI分析PI-

Fluorescence#Events凋亡細胞正常G0/G1期細胞6.注意事項細胞數(shù)目要充分；為防止細胞成團，可在用流式檢測前用篩網(wǎng)過濾?？山Y合科研，將課題組項目中研究的一些凋亡誘導劑作為研究對象進行分析。并在此綜合實驗中掌握動物細胞的傳代技術，細胞凋亡的形態(tài)學分析及流式細胞技術。7.思考題制備流式樣品需要注意哪幾點。還有哪些檢測細胞凋亡的方法？謝謝觀看/歡迎下載BYFAITHIMEANAVISIONOFGOODONECHERISHESANDTHEENTHUSIASMTHATPUSHESONETOSEEKITSFULFILLMENTREGARDLESSOFOBSTACLES.BYFAITHIBYFAITH安全閥基本知識如果壓力容器(設備/管線等)壓力超過設計壓力…1.盡可能避免超壓現(xiàn)象堵塞(BLOCKED)火災(FIRE)熱泄放(THERMALRELIEF)如何避免事故的發(fā)生?2.使用安全泄壓設施爆破片安全閥如何避免事故的發(fā)生?01安全閥的作用就是過壓保護!一切有過壓可能的設施都需要安全閥的保護!這里的壓力可以在200KG以上,也可以在1KG以下!設定壓力(setpressure)安全閥起跳壓力背壓(backpressure)安全閥出口壓力超壓(overpressure)表示安全閥開啟后至全開期間入口積聚的壓力.幾個壓力概念彈簧式先導式重力板式先導+重力板典型應用電站鍋爐典型應用長輸管線典型應用罐區(qū)安全閥的主要類型02不同類型安全閥的優(yōu)缺點結構簡單,可靠性高適用范圍廣價格經(jīng)濟對介質不過分挑剔彈簧式安全閥的優(yōu)點預漏--由于閥座密封力隨介質壓力的升高而降低,所以會有預漏現(xiàn)象--在未達到安全閥設定點前,就有少量介質泄出.100%SEATINGFORCE75502505075100%SETPRESSURE彈簧式安全閥的缺點過大的入口壓力降會造成閥門的頻跳,縮短閥門使用壽命.ChatterDiscGuideDiscHolderNozzle彈簧式安全閥的缺點彈簧式安全閥的缺點=10090807060500102030405010%OVERPRESSURE%BUILT-UPBACKPRESSURE%RATEDCAPACITY普通產(chǎn)品平衡背壓能力差.在普通產(chǎn)品基礎上加裝波紋管,使其平衡背壓的能力有所增強.能夠使閥芯內件與高溫/腐蝕性介質相隔離.平衡波紋管彈簧式安全閥的優(yōu)點優(yōu)異的閥座密封性能,閥座密封力隨介質操作壓力的升高而升高,可使系統(tǒng)在較高運行壓力下高效能地工作.ResilientSeatP1P1P2先導式安全閥的優(yōu)點平衡背壓能力優(yōu)秀有突開型/調節(jié)型兩種動作特性可遠傳取壓先導式安全閥的優(yōu)點對介質比較挑剃,不適用于較臟/較粘稠的介質,此類介質會堵塞引壓管及導閥內腔.成本較高.先導式安全閥的缺點重力板式產(chǎn)品的優(yōu)點目前低壓儲罐呼吸閥/緊急泄放閥的主力產(chǎn)品.結構簡單.價格經(jīng)濟.重力板式產(chǎn)品的缺點不可現(xiàn)場調節(jié)設定值.閥座密封性差,并有較嚴重的預漏.受背壓影響大.需要很高的超壓以達到全開.不適用于深冷/粘稠工況.幾個常用規(guī)范ASMEsectionI-動力鍋爐(FiredVessel)ASMEsectionVIII-非受火容器(UnfiredVessel)API2000-低壓安全閥設計(LowpressurePRV)API520-火災工況計算與選型(FireSizing)API526-閥門尺寸(ValveDimension)API527-閥座密封(SeatTightness)介質狀態(tài)(氣/液/氣液雙相).氣態(tài)介質的分子量&Cp/Cv值.液態(tài)介質的比重/黏度.安全閥泄放量要求.設定壓力.背壓.泄放溫度安全閥不以連接尺寸作為選型報價依據(jù)!如何提供高質量的詢價?彈簧安全閥的結構彈簧安全閥起跳曲線彈簧安全閥結構彈簧安全閥結構導壓管活塞密封活塞導向不平衡移動副(活塞)導管導閥彈性閥座P1P1P2先導式安全閥結構先導式安全閥的工作原理頻跳安全閥的頻跳是一種閥門高頻反復開啟關閉的現(xiàn)象。安全閥頻跳時，一般來說密封面只打開其全啟高度的幾分只一或十幾分之一，然后迅速回座并再次起跳。頻跳時，閥瓣和噴嘴的密封面不斷高頻撞擊會造成密封面的嚴重損傷。如果頻跳現(xiàn)象進一步加劇還有可能造成閥體內部其他部分甚至系統(tǒng)的損傷。安全閥工作不正常的因素頻跳后果1、導向平面由于反復高頻磨擦造成表面劃傷或局部材料疲勞實效。2、密封面由于高頻碰撞造成損傷。3、由于高頻振顫造成彈簧實效。4、由頻跳所帶來的閥門及管道振顫可能會破壞焊接材料和系統(tǒng)上其他設備。5、由于安全閥在頻跳時無法達到需要的排放量，系統(tǒng)壓力有可能繼續(xù)升壓并超過最大允許工作壓力。安全閥工作不正常的因素A、系統(tǒng)壓力在通過閥門與系統(tǒng)之間的連接管時壓力下降超過3%。當閥門處于關閉狀態(tài)時，閥門入口處的壓力是相對穩(wěn)定的。閥門入口壓力與系統(tǒng)壓力相同。當系統(tǒng)壓力達到安全閥的起跳壓力時，閥門迅速打開并開始泄壓。但是由于閥門與系統(tǒng)之間的連接管設計不當，造成連接管內局部壓力下降過快超過3%，是閥門入口處壓力迅速下降到回座壓力而導致閥門關閉。因此安全閥開啟后沒有達到完全排放，系統(tǒng)壓力仍然很高，所以閥門會再次起跳并重復上述過程，既發(fā)生頻跳。導致頻跳的原因導致接管壓降高于3%的原因1、閥門與系統(tǒng)間的連接管內徑小于閥門入口管內徑。2、存在嚴重的渦流現(xiàn)象。3、連接管過長而且沒有作相應的補償（使用內徑較大的管道）。4、連接管過于復雜（拐彎過多甚至在該管上開口用作它途。在一般情況下安全閥入口處不允許安裝其他閥門。）導致頻跳的原因B、閥門的調節(jié)環(huán)位置設置不當。安全閥擁有噴嘴環(huán)和導向環(huán)。這兩個環(huán)的位置直接影響安全閥的起跳和回座過程。如果噴嘴環(huán)的位置過低或導向環(huán)的位置過高，則閥門起跳后介質的作用力無法在閥瓣座和調節(jié)環(huán)所構成的空間內產(chǎn)生足夠的托舉力使閥門保持排放狀態(tài)，從而導致閥門迅速回座。但是系統(tǒng)壓力仍然保持較高水平，因此回座后閥門會很快再次起跳。導致頻跳的原因C、安全閥的額定排量遠遠大于所需排量。

由于所選的安全閥的喉徑面積遠遠大于所需，安全閥排放時過大的排量導致壓力容器內局部壓力下降過快，而系統(tǒng)本身的超壓狀態(tài)沒有得到緩解，使安全閥不得不再次起跳頻跳的原因閥門拒跳：當系統(tǒng)壓力達到安全閥的起跳壓力時，閥門不起跳的現(xiàn)象。安全閥工作不正常的因素1、閥門整定壓力過高。2、閥門內落入大量雜質從而使閥辦座和導套間卡死或摩擦力過大。3、彈簧之間夾入雜物使彈簧無法被正常壓縮。4、閥門安裝不當，使閥門垂直度超過極限范圍（正負兩度