土霉素生產(chǎn)工藝實訓實驗報告

土霉素生產(chǎn)工藝(實訓實驗報告姓 名:班 級：生物學 號:指導教師：目錄TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"第一章緒論 2\o"CurrentDocument"土霉素的簡介 2\o"CurrentDocument"1.2實驗的目的、要求與過程 2\o"CurrentDocument"第二章設備型號 4\o"CurrentDocument"第三章操作步驟 5\o"CurrentDocument"3.1斜面孢子的制備 5\o"CurrentDocument"3.2種子培養(yǎng)基的制備與滅菌 5\o"CurrentDocument"3.3發(fā)酵培養(yǎng)基的配制與滅菌 6\o"CurrentDocument"3.4發(fā)酵 6\o"CurrentDocument"3.5測定前發(fā)酵樣品預處理 6\o"CurrentDocument"土霉素酸化液的發(fā)酵提取 6\o"CurrentDocument"原理 73.6.2酸化提取方法 7\o"CurrentDocument"122#樹脂預處理方法 7\o"CurrentDocument"3.8結品與干燥 83.9相關數(shù)據(jù)的測定 9pH的測定 93.9.2發(fā)酵液效價的測定 9\o"CurrentDocument"3.10標準曲線的繪制 10\o"CurrentDocument"第四章討論 11參考文獻 12第一章緒論1.1土霉素的簡介土霉素是四環(huán)類抗生素，其在結構上含有四并苯的基本母核，隨環(huán)上取代基的不同或位置的不同而構成不同種類的四環(huán)素類抗生素。其結構和命名如圖。土霉素是由龜裂鏈絲菌(S.rimosus)產(chǎn)生的，屬于放線菌中的鏈霉菌屬，他們具有發(fā)育零號的菌絲體，菌絲體分枝捂隔膜，直徑約為0.4?1.0米，長短不一，多核。菌絲體有營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲之分，孢子絲分化成為分生孢子，而龜裂鏈絲菌的菌落為灰白色，后期生褶皺，成龜裂狀。土霉素是典型的次級代謝產(chǎn)物，其發(fā)酵的特點之一就是分批過程分為菌體的生長期、產(chǎn)物期和菌體期三個階段。龜裂鏈絲菌的生長和土霉素的生物合成受到許多發(fā)酵條件的影響：溫度、發(fā)酵PH值、溶氧、接種量、泡沫等。同時還受到一些代謝調控機制的控制，磷酸鹽的調節(jié)作用、ATP的調節(jié)和產(chǎn)生菌生長速率的調節(jié)等。1.2實驗的目的、要求與過程通過專業(yè)綜合訓練我們了解了一種生物產(chǎn)品從上游的菌種培養(yǎng)、發(fā)酵工段到下游的提取純化等工段的完整的生產(chǎn)過程。讓學生們理論聯(lián)系實際，實訓過程中鍛煉了學生的動手與思考能力，在實踐操作中發(fā)現(xiàn)問題并利用自己的專業(yè)知識解決問題。同時讓學生對土霉素這一生產(chǎn)過程有了充分的認識，為后續(xù)的課程設計以及畢業(yè)設計打下了良好的基礎，減少不必要的錯誤，使實驗更加完善。實訓要求我們掌握土霉素生產(chǎn)的工藝流程，掌握分批發(fā)酵的原理，熟悉發(fā)酵罐的滅菌與使用方法；觀察并記錄上罐發(fā)酵過程中菌體的生長變化；掌握土霉素提取結品等工藝的原理及操作步驟；掌握土霉素效價的測定原理及方法。實訓按照土霉素的生產(chǎn)工藝流程進行，首先進行培養(yǎng)基的配制及滅菌，然后菌種培養(yǎng)并開始發(fā)酵，最后對發(fā)酵液處理以及測定產(chǎn)品的效價。由于實訓時間要進行一周左右，并且實驗設備有限，所以我們分組進行實驗，彼此間分工合作，相互協(xié)調。發(fā)酵過程中需要在一定時間內(nèi)進行OD值的測定以及觀察發(fā)酵罐的工作情況，我們小組每個人都積極參與，以保證實訓順利地完成。第二章設備型號主要使用的設備型號編號單位空氣怛溫振蕩器電子天平可見分光光度計HZQ-CMP2002上海精密科學儀器有限公司發(fā)酵罐0303BICF-200220051829空氣壓縮機儲氣罐靜音式全無憂空壓機CW120CF0407303臺州市寓芳壓縮機公司鞍山佳朋壓縮機有限公司離心機樹脂柱LG10-2.4A北京醫(yī)用離心機廠上海亞榮生化儀器廠電熱復空干燥箱自動壓力蒸汽滅菌機磁力攪拌器2K-82BBGI54DWJB-120041041上海實驗儀器有限公司第三章操作步驟3.1斜面孢子的制備無菌條件下，從冷藏的龜裂鏈絲菌（S.rimosus）的斜面孢子中，刮取適量孢子涂在PD（馬鈴薯培養(yǎng)基）斜面上，然后置30°C的恒溫培養(yǎng)3天。我們采用馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)基制作固體試管斜面，它是一種常用培養(yǎng)基，其做法是稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸半個小時，紗布過濾，再加10-20g葡萄糖和17-20g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試驗，每試管約5-10ml（視試管大小而定）馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PD）培養(yǎng)基配方表成分含量馬鈴薯水葡萄糖200g1000ml10-20gPD培養(yǎng)基的滅菌條件：在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)保持121C,0.14MPa下，20分鐘即可。種子斜面：無菌條件下，從冷藏的產(chǎn)生菌的斜面孢子中刮取適量孢子涂在試管斜面上，然后置28-30C的恒溫箱培養(yǎng)3天。傳代兩次，每次接種前挑選長勢較好的孢子進行后面的接種，就可以得到較為強壯、優(yōu)秀的孢子。3.2種子培養(yǎng)基的制備與滅菌種子培養(yǎng)基配方表成分含量淀粉3%黃豆餅粉0.3%硫酸銨0.4%碳酸鈣0.5%玉米漿0.4%氯化鈉0.5%磷酸二氫鉀0.015%按成分配比配制培養(yǎng)基，并加淀粉酶液化后，（就是在白磁板上滴加稀碘液后在加入一定量的培養(yǎng)基液體，待其不變成紫色，這時液化完全）再加入CaCO3,冷卻后調pH值7.0-7.2，分裝，包裝滅菌。滅菌條件：在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)保持121^,0.14Mpa下，20分鐘即可。3.3發(fā)酵培養(yǎng)基的配制與滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方表成分配比淀粉15%黃豆餅粉2%硫酸銨1.4%碳酸鈣1.4%氯化鈉0.4%玉米漿0.4%磷酸二氫鉀0.01%氯化鉆10pg/ml淀粉酶0.1%—0.2%按發(fā)酵培養(yǎng)基成分配比，配制培養(yǎng)J基，并加淀粉酶液化后，（在白磁板上滴加稀碘液后在加入一定量的培養(yǎng)基液體，待其不變成紫色，這時液化完全）再加入CaCO3，冷卻后調pH值7.0—7.2,分裝，包裝滅菌。滅菌條件：在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)保持121^，0.14Mpa下，20分鐘即可。3.4發(fā)酵發(fā)酵液2.5升裝入發(fā)酵罐，離座滅菌。接入電源，將已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基通入無菌空氣，調整好發(fā)酵罐的各類初始參數(shù)：溫度為30°C、pH6.5、攪拌100r/min、泡沫和消泡劑（豆油）自動調節(jié)等。12小時后觀察是否生長雜菌，再將無水乙醇倒入接種口的環(huán)槽內(nèi)，點燃后，進行無菌接種操作，接種量一般為10%。通氣量為1:0.5?1.0vvm，全程用消泡劑消泡，發(fā)酵過程通氨，當接種后發(fā)酵pH低于6.5時就可以開始通氨，通氨量的多少參考pH值。要求73小時前pH在6.3?6.6,72?120小時pH在6.2?6.4,120?140小時pH在6.0?6.2。土霉素的發(fā)酵周期約7天，每隔24小時測一次龜裂鏈絲菌的菌絲濃度，采用721分光光度計在620nm下測發(fā)酵液OD值，同時測定土霉素效價。在菌絲接近自溶期前放罐，得到土霉素發(fā)酵液。3.5測定前發(fā)酵樣品預處理發(fā)酵瓶搖勻，將少量倒入小燒杯，測pH。用9mol/L的鹽酸溶液酸化pH至1.7?2.0攪拌10分鐘，取5ml酸化液至7ml離心管，6000轉離心4分鐘，取上清液，備測。3.6土霉素酸化液的發(fā)酵提取3.6.1原理土霉素在發(fā)酵過程中，所產(chǎn)生的土霉素積聚在菌絲中的濃度并不高。因此，對于土霉素發(fā)酵液進行處理的主要目的就是讓土霉素從菌絲中釋放出來，有利于發(fā)酵液中，有利于從發(fā)酵液中提取土霉素，更能提高土霉素的收率和質量。土霉素發(fā)酵液中預處理首先要進行的操作是酸化，一般用草酸進行酸化。加入草酸的目的是釋放菌絲中的土霉素，同時要保證土霉素的穩(wěn)定性、成品的質量和提煉成本。另外，草酸屬于弱酸，其對設備的腐蝕性要比鹽酸、硫酸小。采用草酸不僅能使土霉素釋放出來并生成溶于水的鹽，并且能析出草酸鈣沉淀，從而去除發(fā)酵液中的鈣離子，同時草酸鈣能促進蛋白質的凝結，從而提高濾液的質量。目前，工業(yè)提煉的pH值控制在1.6?2.0范圍內(nèi)，pH值過高對單位的釋放不利，pH值過低會影響產(chǎn)品的質量，同時會增加產(chǎn)品的成本。去雜過程采用的凈化劑是黃血鹽和硫酸鋅，前者有利于提取出鐵離子，后者有利于凝固蛋白質。此外，兩者的協(xié)同可以產(chǎn)生復鹽，對蛋白質有效應除去蛋白質，同時除去鐵離子。3.6.2酸化提取方法取200ml發(fā)酵液，邊攪拌，邊加入黃血鹽、硫酸鋅，并加入草酸酸化發(fā)酵液，草酸的量通過用酸度計測其pH值來確定，調到所需pH=1.75后，攪拌30分鐘。（黃血鹽的加入量約為酸化前發(fā)酵液的0.35%）酸化后要將酸化液進行適當?shù)南♂?，一般稀?-3倍，有利于過濾脫色過程（本實驗中為兩倍）。本實驗中由于酸化液的粘度較大，用簡單的過濾方法無法得到效果較好的固液分離，所以采用離心（6000r/min、5min）方法實現(xiàn)固液分離，取其上清液（129ml）。3.7122#樹脂預處理方法122#樹脂系弱酸性陽離子酚醛縮聚型，把122#樹脂生產(chǎn)的質量提高到應有的水平，以交換樹脂。自1965年試制成功并投產(chǎn)以來，在便適應抗生素生產(chǎn)發(fā)展之需。鏈霉素脫色，土霉素脫色，四環(huán)素脫色以及維生素q。提取方面廣為應用，并已在全國推廣。⑴將準備裝柱使用的新樹脂，先用熱水（清潔的自來水即可）反復清洗，陽離子交換樹脂可用70-80°C的熱水。開始浸洗時，每隔約15分鐘換水一次，浸洗時不要攪動，換水4-5次后，可隔約30分鐘換水一次，總換水7-8次，浸洗至浸洗水不帶褐色，泡沫很少時為止。水洗后，再經(jīng)酸堿處理，陽離子交換樹脂可按下述步驟處理：用1N鹽酸浸泡樹脂，鹽酸用量為樹脂自身體積的3-5倍，浸泡2-3.5小時。用自來水沖洗全出水pH為5左右，用3倍樹脂體積5%的NaCl溶液浸泡2小時。用1N氫氧化鈉浸泡樹脂，用量約為樹脂本身體積的3-5倍，浸泡2-3.5小時。用水沖洗全出水pH為9左右。用1N鹽酸浸泡樹脂，用量約為樹脂本身體積的3-5倍，浸泡2-3.5小時，將樹脂轉成H型。用酸浸泡完后用去離子水沖洗至出水pH為6以上即可投入使用。對于陰離子交換樹脂水洗后的酸堿處理次序，可采用堿-酸-堿的次序。樹脂預處理過程中，用堿浸泡樹脂，顏色由本身向橘黃色變?yōu)樽睾谏?，再用酸浸泡，樹脂顏色又由棕黑色變?yōu)殚冱S色。將處理后的樹脂填裝入樹脂柱，進行酸化液脫色，脫色時流速不能太大，以免造成脫色不充分。3.8結晶與干燥將一定量脫色液放入燒杯，用堿化劑調pH值到土霉素等電點附近(pH-4.76)。恒溫28C-30C用磁力攪拌器攪拌結品，攪拌轉數(shù)為70rpm。將一定量結品母液倒入培養(yǎng)皿放入ZK-82BB型電熱真空干燥箱中進行干燥，干燥后測定干粉的質量，然后將十粉稀釋10倍，測定其效價。目前生產(chǎn)工藝一般采用pH值4.5-4.7，此工藝去除蛋白比較徹底，可達到短結品時間內(nèi)改善晶體粒度和提高結品收率的目的。在結品時間47min后試驗所得濕品體與原工藝生產(chǎn)(pH值1.75-1.85，黃血鹽鈉2.49g/ml，硫酸鋅1.59g/ml，結品溫度30C，結品pH值4.6、結品時間47min)相比，在結品時間不變的前提下，品體存在明顯差異，原工藝得到的品體粒度細小，分布寬泛，品型主要是針狀和薄片狀；新工藝得到晶體粒度粗壯、均一，品型主要是四棱柱狀，試驗證實其在制取高純度土霉素過程中溶解度提高。新工藝因結品過程雜質干擾較小，pH值控制更接近土霉素等電點，所得結品母液低于原工藝，是提高結品收率的有效措施。⑵3.9相關數(shù)據(jù)的測定3.9.1pH的測定（1） 測樣品不宜在室溫下放置時間過長，應當在取樣2分鐘之內(nèi)測定完，不能直接測定的樣品應收樣放入冰箱，如需測定時提前從冰箱中取出放全室溫測定。（2） 打開酸度計，調節(jié)溫度補償旋鈕全室溫。（3） 用pH=6.86和pH=4.0的緩沖液校準pH計。（4） 校準后，純凈水沖洗電極，將電極放入被測樣中，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀數(shù)。（5） 測定樣品后應該用純凈水沖洗電極，不用時應將電極放置在飽和氯化鉀溶液中。3.9.2發(fā)酵液效價的測定（1） 取樣品加9mol/L的鹽酸溶液，先酸化至pH=1.5-1.7,用酸度計測量，放置5分鐘，過濾至5ml以上，吸取濾液稀釋適宜倍數(shù)（使稀釋后效價在標準曲線范圍內(nèi)），用移液管取1ml稀釋液于試管中，準確加入0.01mol/L的鹽酸，使全量為20ml，再加入0.05%g/ml的三氯化鐵溶液10ml，使全量為20ml，搖勻，放置20分鐘，另取1ml稀釋液，加入0.01mol/L的鹽酸19ml，使全量為20ml，搖勻，放置20分鐘，作為空白，在480nm的波長下測兩種液體的吸光度。（2） 提取過程中間樣效價的測定：取中間樣，稀釋至適宜倍數(shù)（使稀釋后效價在標準曲線范圍內(nèi)），以下操作同發(fā)酵液效價的測定方法。（3） 效價計算：將測定的吸光度值代入標準曲線方程，再乘以稀釋倍數(shù)即得各步效價。（4） 在不同pH值和不同的黃血鹽鈉用量條件下進行了影響酸化液中土霉素效價因素的正交實驗分析；測定酸化液中土霉素效價。通過實驗得到以下結論：1.pH值是酸化工段中影響土霉素質量的主要因素，黃血鹽鈉的用量次之;2.本實驗中最佳酸化條件為:pH值控制在1.43左右，黃血鹽鈉的用量控制在發(fā)酵液體積的0.35%時得到土霉素效價最高，為5102u/g;3經(jīng)過酸化處理后，酸化液中土霉素的效價比發(fā)酵液中土霉素的效價最大提高了47.1%。[3]3.10標準曲線的繪制標準稱取土堿標品25mg，置于三角瓶內(nèi)，加0.1mol/L鹽酸，4mol使之完全溶解，再用0.01mol/L鹽酸按下列公式稀釋成標準液，其中，w為土堿標準品稱樣量。0.01mol/L鹽酸加入量(ml)=土霉素效價xw(mg)/500—ml精密量取標液0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml，分別放入50ml三角瓶中，分別加入0.025%Fecl3溶液至總體積20ml，放入38±1°C水浴中，放置3min，冷卻全室溫測定吸收度，測定波長500nm，同時做空白試驗，不加Fecl3溶液其他相同，總體積20ml。以吸收度為縱坐標，土霉素效價單位為橫坐標，繪制曲線并計算回歸方程及相關系數(shù)。Y為測吸收值，X為曲線中土霉素濃度，r應在0.9990-1.001之間。b=Zxy-nxy/zx2-nx2a=y-bxr=zxy-nxy/[(zx2-nx2)(zy2-ny2)]1/2第四章討論盡管在實驗過程中，我們小組的成員都非常積極主動地進行試驗，然而遺憾的是我們的實驗最終以失敗告終。當我們在實驗過程中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵罐溫度過高以及發(fā)酵液顏色變得越來越深時，沒有進行及時的處理，任其發(fā)展，最終導致了發(fā)酵液糖化，并被大量蒸發(fā)，在測量OD值時出現(xiàn)了讀數(shù)為負的現(xiàn)象。雖然最后發(fā)現(xiàn)發(fā)酵罐本身存在一些問題，但是究其緣